Molekularbiologische und morphologische Untersuchungen zur Skelettentwicklung der Maus:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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| Beschreibung: | München, Techn. Univ., Diss., 1997 |
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INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN UND SYMBOLE
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG.1
1.1 EINLEITUNG.1
1.1.1 GENE, DIE AN DER AUSBILDUNG DES AXIALEN SKELETTES BETEILIGT SIND.3
1.1.2
SOX9 UND KAMPOMELISCHE DYSPLASIE (CD).6
1.1.3 DIE SKELETTMUTANTEN
RBT UND TS.8
1.2 ZIELSETZUNG.10
2 MATERIAL.11
2.1 HAEUFIG VERWENDETE LOESUNGEN UND PUFFER.11
2.2 ENZYME.14
2.3 BAKTERIENSTAEMME.14
2.4 MAUSSTAEMME.15
2.5 ZELLINIEN.15
2.6 VEKTOREN UND KONSTRUKTE.15
2.7 DNA-BANKEN.16
2.8 PRIMER.17
2.9 NORTHEM-BLOTS.18
2.10 ZELLINIEN UND SOMAZELLHYBRIDE.19
2.11 DNA-SONDEN.20
3 METHODEN. 21
3.1 SKELETTPRAEPARATION.21
3.2 HISTOLOGISCHE METHODEN.22
3.2.1 EINBETTUNG VON EMBRYONEN IN PARAFFIN.22
3.2.2 BESCHICHTUNG VON OBJEKTTRAEGERN.22
3.2.3 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG.22
3.2.4 AZAN-FAERBUNG.23
3.3 ES-ZELL-TECHNIK.23
3.3.1 MATERIALIEN UND MEDIEN.23
3.3.2 ANZUCHT VON FEEDERZELLEN.24
3.3.3 KULTUR VON ES-ZELLEN.25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3
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3.4
3
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3.5
3
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3.6
3
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3.7
3
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3.8
3
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3.9
3
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3.10
3.4
3
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4.1
3
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4.2
3
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4
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2.1
3
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4
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2.2
3
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4
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2.3
3
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4.3
3
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3
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3
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3
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4.7
3
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3
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4.9
3
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4.10
3
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4
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10.1
3
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4
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3
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4
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10.3
3
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4
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3
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4
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10.5
3
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4.11
3
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4.42
3
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3
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3
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4
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14.1
3
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4
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3
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4
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14.3
3
.
4
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14.4
3
.
4.15
3
.
4
.
15.1
VORBEREITUNG DES TARGETING-KONSTRUKTES. 26
ELEKTROPORATION.
2
G
POSITIV-NEGATIV-SELEKTION MIT G418 UND GANCYCLOVIR. 27
ISOLIERUNG DER UEBERLEBENDEN KOLONIEN. '
27
SCREENING DER ES-ZELLEN AUS 96-WELL-PLATTEN DURCH MINI-SOUTHEM-BLOT.28
EXPANSION POSITIVER ES-ZELL-KLONE. 28
HERSTELLUNG CHIMAERER MAEUSE.
29
MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN.
30
ALLGEMEINE METHODEN IM UMGANG MIT NUKLEINSAEUREN.
30
DNA-GELELEKTROPHORESE.
3
J
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.
21
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.
3
J
SSCP-ANALYSE."" '' .
32
SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENZYME.
32
SILBERFAERBUNG VON DNA IN POLYACRYLAMIDGELEN.
32
MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.
33
PRAEPARATION VON PLASMID- UND LAMBDA-DNA.
33
PRAEPARATION GENOMISCHER MAUS-DNA.
33
PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS FIBROBLASTEN UND LYMPHOBLASTOIDEN
ZELLEN (AUSSALZMETHODE, NACH MILLER ET AL., 1988).
34
ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN.
34
KLONIERUNGSTECHNIKEN.
34
PHOSPHATASEBEHANDLUNG LINEARER PLASMID-DNA .
34
AUFFUELLEN UEBERSTEHENDER DNA-ENDEN.
LIGATIONEN.
LIGATION EINES LINKERS.
KLONIERUNG DER KONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON
SOX9
IN SITU-SONDEN.36
HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN.
3
G
TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN.
37
POLYMERASE-KETTENREAKTION.
ARBEITEN MIT DNA- UND CDNA-BANKEN.
BESTIMMUNG DES PHAGENTITERS.
3G
AUSPLATTIEREN DER REKOMBINANTEN LAMBDA-PHAGEN.
38
PLAQUE-HYBRIDISIERUNG.
^
HERSTELLEN VON PHAGENLYSATEN.
39
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE.
4Q
SOUTHERN-BLOT (SOUTHERN, 1975), ALKALISCHER BLOT AUF NYLON
(REED AND MANN, 1985).
.35
.35
.35
.37
.38
.40
3.4.15.2 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-SONDEN.41
3.4.15.3 SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG (CHURCH AND GILBERT, 1984).42
3.4.16 NORTHERN-BLOT-HYBRIDISIERUNG.42
3.4.17 DNA-SEQUENZIERUNG.!.43
3.4.17.1 ZYKLISCHE SEQUENZIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN PRIMERN.43
3.4.17.2 ZYKLISCHE SEQUENZIERUNG MIT FLUORESZENZMARKIERTEN DIDESOXYRIBO-
NUKLEOTIDEN.43
3.4.17.3 AUTOMATISCHE DNA-SEQUENZBESTIMMUNG.44
3.5
FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTER (FACS)- ANALYSEN.45
4 ERGEBNISSE.46
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER MAUSMUTANTE
RABO TORCIDO (RBT).46
4.1.1 ENTSTEHUNG UND ZUCHT DER MUTANTE
RBT.46
4.1.2 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MAUSMUTANTE
RBT.47
4.1.3 HISTOLOGISCHE ANALYSE DES RZ?R-PHAENOTYPS.48
4.1.4 SKELETTANOMALIEN VON RBF/+-MAEUSEN.51
4.1.5 PHAENOTYP MIT VARIABLER PENETRANZ.57
4.1.6 SKELETTVERAENDERUNGEN IN
TAIL-SHORT (7V)-TIEREN.59
4.1.7 ANALYSE DES PHAENOTYPS IM IMMUNSYSTEM.61
4.1.8 CYTOGENETISCHE UNTERSUCHUNG.61
4.2 KARTIERUNG DES
RBT- UND JS-LOCUS.62
4.2.1 GENERIERUNG EINES RUECKKREUZUNGSPANELS VON RBT UND TS.63
4.2.2 KARTIERUNG DES
RBT-LOCUS AUF CHROMOSOM 11.63
4.2.3 KARTIERUNG DES FS-LOCUS RELATIV ZU MIKROSATELLITENMARKERN AUF
CHROMOSOM 11.64
4.2.4 AUSSCHLUSS VON KANDIDATENGENEN MITTELS KARTIERUNG ANHAND DES EUCIB-
RUECKKREUZUNGSPANELS.66
4.2.4.1 AUSSCHLUSS DES SOX9-GENS ALS KANDIDATENGEN FUER
RBT UND TS.66
4.2.H.2 KARTIERUNG DES PLAKOGLOBIN-LOCUS.68
4.2.4.3 KARTIERUNG DES
TIMP2-LOCUS.69
4.3 AUSSCHLUSS VON
MOXL ALS KANDIDATENGEN FUER RBT UND TS.70
4.4 KARTIERUNG VON MIKROSATELLITENMARKEM VON CHROMOSOM 11 DER MAUS
AN RATTEN X MAUS-SOMAZELLHYBRIDEN.74
4.5 KARTIERUNG DES
RADICAL FRINGE-LOCUS MITTELS EINES SOMAZELLHYBRID-
PANELS.76
4.6 INAKTIVIERUNG DES SOX9-GENS DURCH HOMOLOGE REKOMBINATION IN
EMBRYONALEN STAMMZELLEN (ES-ZELLEN) UND PRODUKTION CHIMAERER MAEUSE.79
4.6.1 ISOLIERUNG UND ANALYSE VON GENOMISCHEN SOJC9-KLONEN.79
4.6.2
4.6.3
4.6.4
4.7.1
4.7.2
4.7.3
5
HERSTELLUNG DES KONSTRUKTES ZUR INAKTIVIERUNG DES SO;C9-GENS DURCH
HOMOLOGE REKOMBINATION IN EMBRYONALEN STAMMZELLEN.
ISOLIERUNG VON IM 5OX9-LOCUS HOMOLOG REKOMBINIERTEN EMBRYONALEN
STAMMZELLKLONEN NACH TRANSFEKTION MIT DEM SO;C9-TARGETING-KONS{RUKT
PRODUKTION VON CHIMAEREN MAEUSEN.
IDENTIFIZIERUNG VON GENOMISCHEN SOX/O-KLONEN.
CHARAKTERISIERUNG DES SOXLO-GENS.
EXPRESSION DES
SOXLO-GENS.
.83
.87
.90
.93
.94
100
DISKUSSION
101
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
6
7
RBT
UND DIE SKELETTMUTANTE TAIL-SHORT (TS ).
RBT
IST BETEILIGT IN DER AUSBILDUNG DER ANTERIOPOSTERIOREN (A-P) ACHSE.
RBT UND HAEMATOPOESE.
DIE ROLLE VON
MOXL BEI DER SKELETTENTWICKLUNG.
AUSSCHLUSS VON
RBT UND TS ALS MAUSMODELLE DER KAMPOMELISCHEN
DYSPLASIE.
INAKTIVIERUNG EINES ISO.X9-ALLELS DURCH
GENE TARGETING.
CHARAKTERISIERUNG DES
SOXLO-GENS DER MAUS.
AUSBLICK.
101
102
106
107
109
111
113
115
ZUSAMMENFASSUNG
LITERATUR.
117
119
132
133
134
ANHANG A
ANHANG B
ANHANG C |
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