Untersuchung der spannungsabhängigen Ionenkanäle von humanem Annexin V und Annexin VII aus Dictyostelium discoideum durch elektrophysiologische Messungen:
Gespeichert in:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
2.1.
SPANNUNGSABHAENGIGE
LONENKANAELE
3
2.1.1
GRUNDLAGEN
3
2.1.2.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
SPANNUNGSGESTEUERTER
LONENKANAELE
5
2.1.2.1.
KALIUM-,
NATRIUM
UND
CALCIUMKANAELE
5
2.1.2.2.
STRUKTURELL
CHARAKTERISIERTE
SPANNUNGSGESTEUERTE
KANALPROTEINE
6
2.2
DIE
ANNEXINE
8
2.2.1
DIE
ANNEXIN-PROTEINFAMILIE
8
2.2.2.
DIE
ANNEXIN-MEMBRANBINDUNG
11
2.2.2.1.
ANNEXINE
IN
BIOLOGISCHEN
MEMBRANPROZESSEN
11
2.2.2.2.
IN
VIRRO-STUDIEN
ZUR
ANNEXIN-MEMBRANBINDUNG
12
2.2.2.3.
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN
DES
ANNEXIN-MEMBRANKOMPLEXES
13
2.2.3.
ANNEXINV
14
2.2.3.1.
EIGENSCHAFTEN
VON
ANNEXIN
V
14
2.2.3.2.
STRUKTUR
15
2.2.3.3.
LONENKANALAKTIVITAET
16
2.2.4.
ANNEXIN
VII
18
2.2.4.1.
SYNEXIN
UND
ANNEXIN
VII
AUS
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
18
2.2.4.2.
STRUKTUR
DES
ANNEXIN
VII
19
2.2.4.3.
LONENKANALAKTIVITAET
20
3.
ZIELSETZUNG
21
4.
MATERIAL
UND
METHODEN
23
4.1.
MATERIALIEN
23
4.1.1
CHEMIKALIEN
23
4.1.2.
PLASMID-DNA
UND
OLIGONUKLEOTIDE
23
4.1.2.1.
PLASMID
PT7-7-DDAVII
23
4.1.2.2.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
MUTAGENESE
UND
SEQUENZIERUNG
24
4.1.3.
BAKTERIENSTAEMME
25
4.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
26
4.2.1.
KULTIVIERUNG
UND
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
26
4.2.1.1.
FLUESSIGKULTUREN
26
4.2.1.2.
PLATTENKULTUREN
27
4.2.1.3.
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
27
4.2.1.4.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
27
4.2.2.
REINIGUNG
VON
PLASMIDEN
UND
LINEARER
DNA
27
4.2.2.1.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
27
4.2.2.2.
SCHNELLPRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
28
INHALTSVERZEICHNIS
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
4.2.2.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
28
4.2.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
DNA
29
4.2.3.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
29
4.2.3.2.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
29
4.2.3.3.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
29
4.2.3.4.
DNA-SEQUENZIERUNG
30
4.2.4.
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PT7
-7
DDA
VIIC-E2
1
5G
30
4.2.4.1.
MUTAGENESE
MIT
DEM
QUIKCHANGEYY
SITE-DIRECTED
MUTAGENESIS
KIT
30
4.2.4.2.
MUTAGENESE
DURCH
PCR
MIT
TAQ-POLYMERASE
30
4.2.4.3.
ZIRKULARISIERUNG
DES
LINEAREN
VEKTORS
MIT
T4-LIGASE
31
4.3.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
32
4.3.1.
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
ANNEXIN
V
UND
DESSEN
MUTANTEN
32
4.3.1.1.
ANZUCHT
DER
EXPRESSIONSKULTUR
32
4.3.1.2.
ZELLAUFSCHLUSS
UND
ULTRAZENTRIFUGATION
32
4.3.1.3.
REVERSIBLE
BINDUNG
VON
ANNEXIN
AN
LIPOSOMEN
33
4.3.1.4.
REINIGUNG
DURCH
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
33
4.3.2.
REINIGUNG
DER
ANNEXIN
VII-MUTANTE
E215G
34
4.3.2.1.
REINIGUNG
NACH
DER
VORSCHRIFT
FUER
DAS
ANNEXIN
VUE-CORE
34
4.3.2.2.
ISOLIERUNG
DER
BAKTERIELLEN
EINSCHLUSSKOERPER
VON
E215G
34
4.3.2.3.
GELFILTRATION
DER
DENATURIERTEN
FRAKTION
34
4.3.2.4.
RENATURIERUNG
35
4.3.2.5.
REVERSIBLE
LIPOSOMENBINDUNG
35
4.3.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
36
4.3.3.1.
AUFKONZENTRIERUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
36
4.3.3.2.
DENATURIERENDE
DISKONTINUIERLICHE
GELELEKTROPHORESE
37
4.3.3.3.
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
SDS-GELEN
38
4.3.3.4.
SILBERFAERBUNG
VON
SDS-GELEN
38
4.4.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
METHODEN
39
4.4.1.
DER
CALCIUM-EINSTROMTEST
(FURA-ASSAY)
39
4.4.1.1.
HERSTELLUNG
VON
FURA-2
BELADENEN
PHOSPHOLIPID-VESIKELN
39
4.4.1.2.
MESSUNG
DES
CALCIUMEINSTROMS
IN
VESIKEL
MIT
DEM
FLUORESZENZFARBSTOFF
FURA2
39
4.4.2.
UNTERSUCHUNG
VON
LONENKANALAKTIVITAET
IN
PLANAREN
MEMBRANEN
40
4.4.2.1.
MEMBRANBILDUNG
NACH
MONTAL-MUELIER
40
4.4.2.2.
AUFZEICHNUNG
VON
STROMKURVEN
42
4.4.2.3.
DATENANALYSE
42
4.4.3.
AUFZEICHNUNG
UND
AUSWERTUNG
DER
STROEME
EINZELNER
LONENKANAELE
43
4.4.3.1.
AUFBAU
DER
PATCH-CLAMP-APPARATUR
43
4.4.3.2.
HERSTELLUNG
VON
PIPETTEN
FUER
MESSELEKTRODEN
44
4.4.3.3.
BILDUNG
VON
GIGADICHTUNGEN
AUS
LIPOSOMEN
45
4.4.3.4.
DIE
FIP-DIP-METHODE
46
4.4.3.5.
INKORPORIERUNG
VON
ANNEXIN-KANAELEN
IN
MEMBRANEN
47
4.4.3.6.
SIGNALDETEKTION
UND
SPEICHERUNG
49
4.4.3.7.
PRINZIPIEN
DER
DATENAUSWERTUNG
50
INHALTSVERZEICHNIS
4.5.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
53
4.5.1.
PRAEPARATEHERSTELLUNG
53
4.5.1.1.
DARSTELLUNG
VON
LOCHFOLIEN
AUF
KUPFEMETZEN
53
4.5.1.2.
ANNEXINKRISTALLISATION
AN
LIPIDMONOSCHICHTEN
53
4.5.1.3.
NEGATIVKONTRASTIERUNG
UND
KOHLENSTOFFBEDAMPFUNG
DER
PROBEN
54
4.5.2.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
UND
BILDVERARBEITUNG
54
4.5.2.1.
AUFNAHMETECHNIK
54
4.5.2.2.
OPTISCHE
DIFFRAKTION
AN
NEGATIVEN
54
4.5.2.3.
COMPUTERUNTERSTUETZTE
BILDPROZESSIERUNG
55
5.
ERGEBNISSE
56
5.1.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
AN
MUTANTEN
DES
HUMANEN
ANNEXIN
V
56
5.1.1.
DIE
PORENMUTANTE
ELI2G
56
5.1.1.1.
STRUKTUR
UND
STABILITAET
56
5.1.1.2.
LEITFAEHIGKEITEN
UND
SELEKTIVITAET
VON
E112G
56
5.1.1.3.
KINETISCHES
VERHALTEN
VON
EL
12G
60
5.1.2.
MUTATIONEN
DER
SALZBRUECKE
ELI
2/R27
1
MIT
GELADENEN
AMINOSAEURERESTEN
61
5.1.2.1.
DIE
SALZBRUECKENAUSTAUSCHMUTANTE
EL
12R/R271E
61
5.1.2.2.
DIE
PORENMUTANTE
EL
12R
64
5.1.2.3.
DIE
MUTANTE
R27IE
67
5.1.3.
DIE
PORENMUTANTE
D92S
69
5.1.3.1.
STRUKTURELLE
GEGEBENHEITEN
69
5.1.3.2.
LEITFAEHIGKEITEN
UND
SELEKTIVITAET
VON
D92S
70
5.1.3.3.
KINETISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
D92S
71
5.1.4.
SELENO
UND
TELLUROMETHIONIN-MUTANTEN
DES
ANNEXIN
V
73
5.1.4.1.
EINBAU
VON
SELENO
UND
TELLUROMETHIONIN
IN
ANNEXIN
V
73
5.1.4.2.
LONENKANALEIGENSCHAFTEN
DER
SELENOMETHIONIN-MUTANTE
74
5.1.4.3.
LONENKANALEIGENSCHAFTEN
DER
TELLUROMETHIONIN-MUTANTE
75
5.2.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
MESSUNGEN
MIT
WILDTYP-ANNEXIN
V
78
5.2.1.
ANNEXIN
V-KANALAKTIVITAET
AN
CHOLESTEROLHALTIGEN
MEMBRANEN
78
5.2.1.1.
CALCIUMEINSTROM
IN
PHOSPHOLIPIDVESIKEL
MIT
CHOLESTEROLANTEIL
78
5.2.1.2.
EINZELKANALMESSUNGEN
AN
CHOLESTEROLHALTIGEN
PHOSPHOLIPIDMEMBRANEN
79
5.2.2.
MESSUNGEN
AN
PLANAREN
LIPIDDOPPELSCHICHTEN
81
5.2.2.1.
UNTERSUCHUNG
DER
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEITEN
FUER
DIE
ANNEXIN
V-
KANALAKTIVITAET
81
5.2.2.2.
LEITFAEHIGKEITSMESSUNGEN
81
5.2.2.3.
KAPAZITAETSMESSUNGEN
84
5.3.
UNTERSUCHUNG
DES
ANNEXIN
VII
AUS
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
85
5.3.1.
KANALEIGENSCHAFTENDES
VOLLAENGE-UND
DESN-TERMINALVERKUERZTENANNEXIN
VII
86
5.3.1.1.
CALCIUM
UND
MAGNESIUMLEITFAEHIGKEITEN
87
5.3.1.2.
LEITFAEHIGKEITEN
UND
SELEKTIVITAET
FUER
NATRIUM,
KALIUM
UND
CAESIUM
88
5.3.1.3.
KINETISCHES
VERHALTEN
VON
ANNEXIN
VII
AUS
D.
DISCOIDEUM
90
INHALTSVERZEICHNIS
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
5.3.2.
DIE
ANNEXIN
VII-MUTANTE
E2
1
5G
91
5.3.2.1.
MUTAGENESE
UND
HERSTELLUNG
DES
EXPRESSIONSSYSTEMS
92
5.3.2.2.
PROTEINREINIGUNG
92
5.3.2.3.
LEITFAEHIGKEITEN
UND
SELEKTIVITAET
DER
MUTANTE
E215G
93
5.3.2.4.
KINETISCHE
EIGENSCHAFTEN
94
6.
DISKUSSION
96
6.1.
DIE
INKORPORIERUNG
VON
ANNEXIN-IONENKANAELEN
IN
MEMBRANEN
96
6.1.1.
LONENLEITUNG
DURCH
DAS
PROTEIN
UND
DIE
MEMBRAN
9
6
6.1.1.1.
DIE
ANNEXIN-PORE
ALS
LONENLEITWEG
9
6
6.1.1.2.
DER
ANEXIN
V-MEMBRANKOMPLEX
IM
LEITENDEN
ZUSTAND
97
6.1.1.3.
EIN
VERGLEICH
MIT
DEN
COLICINEN
98
6.1.1.4.
DIE
ELEKTROPORATIONSHYPOTHESE
99
6.1.1.5.
ALTERNATIVE
MODELLE
DES
IONENLEITENDEN
ANNEXIN
-MEMBRANKOMPLEXES
99
6.1.2.
INTERPRETATION
DER
MESSUNGEN
MIT
WILDTYP-ANNEXIN
V
100
6.1.2.1.
DIE
BEEINFLUSSUNG
DER
ANNEXIN
V-KANALAKTIVITAET
DURCH
CHOLESTEROL
100
6.1.2.2.
MESSUNG
MAKROSKOPISCHER
STROEME
AN
PLANAREN
MEMBRANEN
101
6.2.
EINZELKANALMESSUNGEN
AN
ANNEXIN
V-MUTANTEN
104
6.2.1.
DIE
MUTATIONSANALYSE
DES
ANNEXIN
V
ERGIBT
EIN
MODELL
DES
LONENLEITUNGSMECHANISMUS
104
6.2.1.1.
LONENPERMEATION
UNDLEITFAEHIGKEITSNIVEAUS
104
6.2.1.2.
SELEKTIVITAET
105
6.2.2.3.
DIE
KINETIK
DES
ANNEXIN
V-KANALS
106
OE.2.2.4.
VORSCHLAG
EINES
MOEGLICHEN
MECHANISMUS
DER
LONENLEITUNG
IN
ANNEXIN
V
107
6.3.
DER
LONENKANAL
DES
ANNEXIN
VII
AUS
D.
DISCOIDEUM
110
6.3.1.
ANNEXIN
VII
BESTAETIGT
DIE
PORE
ALS
LONENLEITWEG
110
6.3.1.1.
DIE
KANALEIGENSCHAFTEN
DES
N-TERMINAL
VERKUERZTEN
UND
DES
VOLLAENGE
ANNEXINVUE
110
6.3.1.2.
DIE
KINETIK
DER
ANNEXIN
VII-KANAELE
111
6.3.2.
DIE
ANNEXIN
VII-MUTANTEE215G
111
6.4.
DIE
RELEVANZ
DER
LONENKANALAKTIVITAET
DER
ANNEXINE
FUER
IHRE
PHYSIOLOGISCHE
ROLLE
112
6.4.1.
IN
VIVO-FUNKTION
VON
ANNEXINEN
ALS
LONENKANAELE
112
6.4.2.
ANNEXINE
IN
ENDO-UND
EXOCYTOTISCHEN
PROZESSEN
112
6.5.
AUSBLICK
113
7.
LITERATURVERZEICHNIS
114
8.
ANHANG
136
8.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
136
8.2.
BUCHSTABENCODE
UND
ABKUERZUNGEN
DER
AMINOSAEUREN
138
BISHERIGE
VEROEFFENTLICHUNGEN
141 |
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