Regulation der hochaffinen Bindung von Sulfonylharnstoffen an SUR1 durch Nucleotide und Nucleotidanaloga:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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| adam_text | REGULATION DER HOCHAFFINEN BINDUNG VON SULFONYLHARNSTOFFEN AN SURL DURCH
NUCLEOTIDE UND NUCLEOTIDANALOGA VON DER GEMEINSAMEN
NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET
CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINER
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) GENEHMIGTE DISSERTATION
VON ANNE HEIKE SIEVERDING AUS LEVERKUSEN INHALTSVERZEICHNIS VERZEICHNIS
DER ABKUERZUNGEN VI 1. EINLEITUNG 1 1.1. THERAPIE DES TYP-II-DIABETES
MELLITUS 1 1.2. SULFONYLHARNSTOFFE 1 1.2.1. ENTWICKLUNG 1 1.2.2.
WIRKMECHANISMUS 2 1.2.2.1. STIMULATION DER INSULINSEKRETION 2 1.2.2.2.
HEMMUNG DES K ATP -KANALS DER B-ZELLE 5 1.3. BEDEUTUNG ATP-SENSITIVER
KALIUMKANAELE 5 1.3.1. K ATP -KANAL DER B-ZELLE 6 1.3.2. K ATP -KANAL IN
NEURONEN 6 1.3.3. K ATP -KANAL AM HERZEN 7 1.3.4. K ATP -KANAELE AN
SKELETT-UND GLATTER MUSKULATUR 7 1.4. SULFONYLHARNSTOJFREZEPTOREN 8
1.4.1. NACHWEIS IN GEWEBEN 8 1.4.2. KLONIERUNG DES
SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORS 8 1.4.3. SURS SIND ABC-CASSETTENPROTEINE 9
1.5. STRUKTUR VON KA RP-KANAELEN 10 1.6. PHHI ALS FOLGE REDUZIERTER
OFFENWAHRSCHEINLICHKEIT VON SUR1/KIR6.2-KANAELEN 11 1.7. PHARMAKOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG DES REKOMBINANTEN SURL 12 1.8.
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG DES NATIVEN SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORS 12 1.9.
MODULATION DER SULFONYLHARNSTOFFBINDUNG DURCH NUCLEOTIDE 12 2.
ZIELSETZUNG DER ARBEIT 14 II 3. MATERIAL UND METHODEN 15 3.1.
KULTIVIERUNG, PASSAGIERUNG UND KONSERVIERUNG VON COS / -ZELLEN 15 3.1.1.
LOESUNGEN UND MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR 15 3.1.2. KULTIVIERUNG VON
C0S7-ZELLEN 16 3.1.3. UMSETZEN DER ZELLEN (PASSAGIEREN) 16 3.1.4.
KRYOKONSERVIERUNG VON COS7-ZELLEN 16 3.2. HERSTELLUNG DER
PUNKTMUTATIONEN 17 3.3. TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 18 3.3.1.
LOESUNGEN FUER DIE TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 18 3.3.2.
HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER ZELLEN 21 3.3.3. DURCHFUEHRUNG DER
TRANSFORMATION 22 3.3.4. PLASMIDPRAEPARATION 22 3.4. TRANSFEKTION 23
3.4.1. LOESUNGEN FUER DIE TRANSFEKTION 23 3.4.2. TRANSFEKTION MITTELS
DEAE-DEXTRAN-METHODE 24 3.5. MEMBRANPRAEPARATION 25 3.5.1. LOESUNGEN FUER
DIE MEMBRANPRAEPARATION 25 3.5.2. PRAEPARATION VON MEMBRANEN AUS
COS-ZELLEN 26 3.6. PROTEINBESTIMMUNG 26 3.6.1. LOESUNGEN FUER DIE
PROTEINBESTIMMUNG 26 3.6.2. DURCHFUEHRUNG DER PROTEINBESTIMMUNG 27 3.7.
SYNTHESE DES IOD-AZIDOGLIBENCLAMIDANALOGS 27 3.7.1. LOESUNGEN FUER DIE
IODIERUNG BZW. RADIOIODIERUNG VON N 3 -GA 27 3.7.2. REAKTIONSANSATZ FUER
DIE NICHT-RADIOAKTIVE IODIERUNG VON N 3 -GA 28 3.7.3. REAKTIONSANSATZ
FUER DIE RADIOAKTIVE IODIERUNG VON N 3 -GA 29 3.7.4. TRENNUNG MIT HPLC 29
3.8. BINDUNGSEXPERIMENTE AN COS-MEMBRANEN 30 3.8.1. LOESUNGEN FUER DIE
BINDUNGSEXPERIMENTE 30 3.8.1.1. LOESUNGEN DER RADIOLIGANDEN 30 3.8.1.2.
STAMMLOESUNGEN VON SULFONYLHARNSTOFFEN UND MEGLITINID 30 3.8.1.3.
LOESUNGEN DER NUCLEOTIDE 31 3.8.1.4. LOESUNGEN FUER DIE VERSUCHE MIT
HEXOKINASE/GLUCOSE 32 III 3.8.2. VORBEREITUNG DER MEMBRANEN 3.8.3.
GLEICHGEWICHTSBINDUNGSEXPERIMENTE 3.8.3.1. PRINZIP DES FILTRATIONSASSAYS
3.8.3.2. INKUBATIONEN 3.8.3.2.1. KINETIKEXPERIMENTE 3.8.3.2.1.1.
ASSOZIATION 3.8.3.2.1.2. DISSOZIATION 3.8.3.2.2. VERDRAENGUNGSEXPERIMENTE
BEI GLEICHGEWICHTSBINDUNG 3.8.3.3. FILTRATION UND SZINTILLATIONSZAEHLUNG
3.8.4. PRINZIP DES ZENTRIFUGATIONSASSAYS 3.8.4.1. INKUBATION 3.8.4.2.
ZENTRIFUGATION UND Y-ZAEHLUNG 3.9. PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG 3.10.
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PA GE) 3.10.1.
LOESUNGEN FUER DIE SDS-PAGE 3.10.2. FERTIGUNG DER SDS-POLYACRYLAMIDGELE
3.10.3. PROBENVORBEREITUNG UND AUFTRENNUNG 3.10.4. FAERBUNG UND
AUTORADIOGRAPHIE DER GELE 3.11. DATENAUSWERTUNG 3.11.1. STATISTIK
3.11.2. KINETIKEN 3.11.3. GLEICHGEWICHTSBINDUNGEN 3.11.4.
DISSOZIATIONSKONSTANTEN 3.11.5. ZAHL DER REZEPTOREN 32 32 32 33 33 33 33
34 34 34 34 35 35 36 36 38 38 39 39 39 39 40 40 41 IV 4. ERGEBNISSE 4.1.
TRANSIENTE EXPRESSION VON SURL IN COS / -ZELLEN 4.2. CHARAKTERISIERUNG
DES REKOMBINANTEN SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORS 4.3. KINETIKEN FUER DIE
BINDUNG VON GLIBENCLAMID 4.4. PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG VON SURL AA. 1.
BINDUNG DES IOD-AZIDOGLIBENCLAMIDANALOGS AN SURL 4.4.2.
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG VON SURL UND KIR6.2 4.5. REGULATION DES
SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORS DURCH NUCLEOTIDE 42 42 42 43 45 45 46 47
4.5.1. KONZENTRATIONSWIRKUNGSBEZIEHUNGEN FUER HYDROLYSIERBARE NUCLEOTIDE
47 4.5.2. EFFEKT MICROMOLARER NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN AUF DIE
SULFONYLHARN- STOFFBINDUNG 48 4.5.2.1. HYDROLYSIERBARE NUCLEOTIDE 48
4.5.2.2. EINFLUSS VON MGATP AUF DIE AFFINITAET FUER DIE BINDUNG VON
GLIBENCLA- MID 51 4.5.2.3. SYNTHETISCHE NUCLEOTIDANALOGA 52 4.5.3.
EINFLUSS VON MUTATIONEN IN DEN NBFS AUF DEN EFFEKT VON MGATP 53 4.5.4.
FUNKTIONELLE BEDEUTUNG DER LYSINRESTE IN DEN WALKER A-MOTIVEN VON SURL
56 4.5.5. BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN VON GLIBENCLAMID AN
MUTATIONEN 57 4.5.6. EFFEKT MILLIMOLARER NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN AUF
DIE SULFONYLHARN- STOFFBINDUNG 59 4.5.6.1. HYDROLYSIERBARE NUCLEOTIDE 59
4.5.6.2. MAGNESIUMABHAENGIGKEIT DES EFFEKTS MILLIMOLARER ATP-
KONZENTRATIONEN 60 4.5.6.3. SAETTIGUNGSBINDUNG IN GEGENWART VON 2 MM
MGATP 62 4.5.6.4. SYNTHETISCHE NUCLEOTIDANALOGA 63 4.5.6.5. HEMMUNG DER
INKORPORATION VON [ 12S I]N 3 -GA DURCH NUCLEOTIDE 65 4.5.7. EINFLUSS VON
MUTATIONEN IN DEN NBFS AUF DEN EFFEKT VON MILLI- MOLAREM ATP 66 5.
DISKUSSION 68 5.1. SURL REPRAESENTIERT DEN SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOR DER
B-ZELLE DES PANKREAS 68 5.2. KIR6.2 ENTSPRICHT DEM IN NATIVEN MEMBRANEN
IDENTIFIZIERTEN 38 KDA PROTEIN 68 5.3. REGULATION DER
SULFONYLHARNSTOFFREZEPTORBINDUNGSSTELLE AUF SURL DURCH NUCLEOTIDE 70
5.3.1. MICROMOLARE NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN 70 5.3.1.1. ATP-ABHAENGIGE
HEMMUNG DER BINDUNG VON GLIBENCLAMID 70 5.3.1.2. BEIDE NBFS SIND AN DER
REGULATION DER BINDUNG VON GLIBENCLAMID BETEILIGT 72 5.3.1.3. MODELL FUER
DIE REGULATION DER SULFONYLHARNSTOFFBINDUNG AN SURL DURCH MICROMOLARE
NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN 74 5.3.1.4. FUNKTIONELLE BEDEUTUNG DER
LYSINRESTE IN DEN WALKER A-MOTIVEN VON SURL 75 5.3.2. MILLIMOLARE
NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN 76 5.3.2.1. MILLIMOLARE
NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN BEWIRKEN EINE STARKE HEM- MUNG DER
GLIBENCLAMIDBINDUNG AN SURL 76 5.3.2.2. MAGNESIUMABHAENGIGKEIT DES
HEMMEFFEKTS 77 5.3.2.3. BEEINFLUSSUNG DES ATP-EFFEKTS DURCH SYNTHETISCHE
NUCLEOTIDANALOGA 78 5.3.2.4. EINFLUSS VON MUTATIONEN IN DEN NBFS AUF DEN
HEMMEFFEKT VON MILLI- MOLAREM ATP 79 5.3.2.5. ZUSAMMENFASSUNG:
REGULATION DER SULFONYLHARNSTOFFBINDUNG AN SURL DURCH MILLIMOLARE
NUCLEOTIDKONZENTRATIONEN 80 6. ZUSAMMENFASSUNG 81 7.
LITERATURVERZEICHNIS 83
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