Regulationsmechanismen der beta-adrenergen Signalübertragung:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1998
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X
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND
PHARMAZIE
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
REGULATIONSMECHANISMEN DER SS-ADRENERGEN
SIGNALUEBERTRAGUNG
VON
STEFAN DANNER
AUS
ROSENHEIM
MUENCHEN 1998
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I. ZUSAMMENFASSUNG 1
H. EINLEITUNG 3
1. G-PROTEIN-GEKOPPELTE SIGNALUEBERTRAGUNG 3
2. G-PROTEINE UND IHRE REGULATION 7
2.1. G-PROTEIN ZYKLUS 7
2.2. G-PROTEIN UNTEREINHEITEN 7
2.3. G-PROTEIN REGULATOREN 10
2.4. PHOSDUCIN 11
3. MECHANISMEN DER P2AR DESENSIBILISIERUNG 12
3.1. REZEPTORPHOSPHORYLIERUNG - FUNKTIONEILE ENTKOPPLUNG 13 3.2.
REZEPTORSEQUESTRIERUNG- RAEUMLICHE ENTKOPPLUNG 16
3.3. VERRINGERUNG DER REZEPTORZAHL - DOWN-REGULATION 17
3.4. REGULATION DER REZEPTORGENEXPRESSION 18
3.5. PHYSIOLOGISCHE RELEVANZ DER REZEPTORDESENSIBILISIERUNG 23 4.
ZIELSETZUNG 25
UI. MATERIAL UND METHODEN 26
1. MATERIAL : 26
1.1. CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 26
1.2. ENZYME 27
1.3. BIOLOGISCHES MATERIAL 27
1.3.1. BAKTERIENSTAEMME 27
1.3.2. ZELLINIEN 28
1.3.3. ADULTE RATTENKARDIOMYOZYTEN 28
1.3.4. PLASMIDE 28
1.3.5. OLIGONUKLEOTIDPRIMER 30
1.3.6. ANTIKOERPER 31
1.4. MEDIEN UND PUFFER 31
1.4.1. MEDIEN FUER DIE KULTUR VON E. COLI 31
1.4.2. MEDIEN FUER DIE KULTUR EUKARYONTISCHER ZELLEN 32
1.4.3. ALLGEMEINE PUFFER 32
2. METHODEN 33
2.1. KULTUR VON ZELLEN 33
2.1.1. KULTUR UND STAMMHALTUNG VON E. COLI. 33
2.1.2. KULTUR EUKARYONTISCHER ZELLEN 33
2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 33
2.2.1. ISOLATION VON PLASMID-DNA 33
2.2.1.1. PLASMIDMINIPRAEPARATIONEN 33
2.2.1.2. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA MIT QIAGEN-SAEULEN 34 2.2.2.
ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA 35
2.2.2.1. SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 35
2.2.2.2. UEBERFUEHRUNG VON KOHAESIVEN IN GLATTE DNA-ENDEN 35 2.2.2.3.
5 -DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 35 2.2.2.4. LIGATION VON
DNA-FRAGMENTEN 35
2.2.2.5. SUBKLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 36
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3. AUFTRENNUNG UND REINIGUNG VON DNA MITTELS
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE36 2.2.4. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN 36
2.2.5. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 37
2.2.5.1. PRINZIP UND DURCHFUEHRUNG DER PCR 37
2.2.5.2. ANCHORED (NESTED) PCR 38
2.2.5.3. QUANTITATIVE RT-PCR 38
2.2.6. SEQUENZIERUNG VON DNA 38
2.2.7. TRANSFORMATION VON E. COLI 39
2.2.7.1. TRANSFORMATION MITTELS TSB/KCM 39
2.2.7.2. TRANSFORMATION MITTELS ELEKTROPORATION 39
2.2.8. TRANSIENTE TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 40
2.2.9. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 40
2.2.10. ISOLIERUNG VON POLY(A)+-RNA 41
2.2.11. REVERSE TRANSKRIPTION (CDNA-SYNTHESE) 42
2.2.12. RNA-GELELEKTROPHORESE 42
2.2.13. NORTHERN-TRANSFER 42
2.2.13.1. HERSTELLUNG DIGOXIGENIN-MARKIERTER SONDEN 42
2.2.13.2. TRANSFER VON RNA AUF NYLONMEMBRANEN 43
2.2.13.3. HYBRIDISIERUNG UND CHEMILUMINESZENZNACHWEIS 43
2.2.14. PRIMER EXTENSION-ANALYSE 44
2.2.14.1. VORBEHANDLUNG DER RNA UND 5 -MARKIERUNG DES PRIMERS 44
2.2.14.2. PRIMER-ANNEALING UND EXTENSION-REAKTION 44
2.2.15. GEL-RETARDATIONSANALYSE (GEL-SHIFT ASSAY) 45
2.2.15.1./NVITRO-TRANSKRIPTION 45
2.2.15.2. GEL-RETARDATION 46
2.2.16. COMPUTERPROGRAMME 46
2.3. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 46
2.3.1. HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN 46
2.3.1.1. CYTOSOL-PRAEPARATION AUS DDTI-MF2 ZELLEN 46
2.3.1.2. CYTOSOL-PRAEPARATION AUS GEWEBE 46
2.3.2; PRAEPARATION VON ZELLMEMBRANEN 47
2.3.3. PROTEINBESTIMMUNG 47
2.3.4. REINIGUNG VON IGG MITTELS CAPRYLSAEURE-FAELLUNG 47
2.3.5. IMMUNPRAEZIPITATION 47
2.3.6. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 48
2.3.7. TRANSFER VON PROTEINEN AUF PVDF-MEMBRANEN 48
2.3.8. IMMUNOLOGISCHE DETEKTION VON IMMOBILISIERTEN PROTEINEN 49 2.3.9.
BESTIMMUNG DER SSAR-ZAHL IN ZELLMEMBRANEN 49
2.3.10. BESTIMMUNG DER ADENYLYLCYCLASE-AKTIVITAET 49
IV. PHOSDUCIN - EIN UBIQUITAERER G-PROTEIN REGULATOR 51
1. ERGEBNISSE 51
1.1. AMPLIFIKATION UND SEQUENZANALYSE DER KODIERENDEN REGION VON
PHOSDUCIN 51 1.2. TRANSKRIPTION DES PHOSDUCIN-GENS 53
1.3. CHARAKTERISIERUNG DER PHOSDUCIN-TRANSKRIPTE 55
1.4. NACHWEIS VON PHOSDUCIN IN WESTERN-ANALYSEN 57
1.5. NACHWEIS VON PHOSDUCIN MITTELS IMMUNPRAEZIPITATION 58
1.6. MASKIERUNG VON PHOSDUCIN 61
1.7. HEMMUNG DER ADENYLYLCYCLASE-AKTIVITAET IN A431-ZELLMEMBRANEN 62
INHALTSVERZEICHNIS
2. DISKUSSION 65
2.1. GEWEBEVERTEILUNG VON PHOSDUCIN 65
2.2. REGULATION DER PHOSDUCIN-GENEXPRESSION 68
2.3. PHOSDUCIN ALS UBIQUITAERER G-PROTEIN REGULATOR 72
V. REGULATION DER SS 2-ADRENERGEN REZEPTOR EXPRESSION 76
1. ERGEBNISSE 76
1.1. ZELLTYP-SPEZIFISCHE REGULATION DER SS2AR-EXPRESSION...; 76
1.1.1. ZELLKULTURBEDINGUNGEN - EIN KRITISCHER PARAMETER DER
SS2AR-REGULATION ....76 1.1.2. VERGLEICH ZWEIER METHODEN ZUR
QUANTIFIZIERUNG DER SS2AR MRNA 77 1.1.3. BESTIMMUNG DER SS2AR
MRNA-HALBWERTSZEIT IN DDT]-MF2 ZELLEN 79 1.1.4. VERGLEICH DER SS
2AR-REGULATION IN DDTI-MF2 BZW. C6 GLIOMA-ZELLEA...81 1.1.5. REGULATION
DER SS2AR MRNA IN ISOLIERTEN RATTENKARDIOMYOZYTEN 84 1.2.
CHARAKTERISIERUNG DER AGONIST-SENSITIVEN REGION DER HUMANEN SS2AR
MRNA...87
1.2.1. KARTIERUNG DER AGONIST-SENSITIVEN REGION DER SS2AR-TRANSKRIPTS 87
1.2.2. CHARAKTERISIERUNG EINES AU-REICHEN ELEMENTS IN DER SS2AR 3TJTR 90
1.2.3. STABILITAET EINES CHIMAEREN SS-GLOBIN/SS2AR 3 UTR-TRANSKRIPTS 98
1.2.4. AUF1 ALS POTENTIELLER REGULATOR DER SS2AR MRNA-STABILITAET 101
2. DISKUSSION 103
2.1. ZELLTYP-SPEZIFISCHE REGULATION DER SS2AR-GENEXPRESSION 103
2.2. KARTIERUNG DER AGONIST-SENSITIVEN REGION DER HUMANEN SS2AR MRNA 107
2.3. AUF1 - EIN REGULATOR DER SS2AR-TRANSKRIPTSTABILITAET? 115
VI. LITERATURVERZEICHNIS
VH. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS..
.119
.143
DANKSAGUNG 145
PUBLIKATIONEN 146
LEBENSLAUF. 147
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