Die beiden Phytochrome in Ceratodon purpureus: Sichtung nach wechselwirkenden Protein-Komponenten im Two-Hybrid-System sowie Überexpression und Rekonstitution
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1998
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| adam_text | DIE BEIDEN PHYTOCHROME IN CERATODON PURPUREUS: SICHTUNG NACH
WECHSELWIRKENDEN PROTEIN-KOMPONENTEN IM TWO-I LYBRID SYSTEM SOWIE
UEBEREXPRESSION UND REKONSTITUTION. DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN VORGELEGT VON NICOLA PAULO 9.
APRIL 1998 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 1.1 PFLANZEN NEHMEN IHRE
UMWELT WAR 1 1.2 DAS PHYTOCHROM-SYSTEM ,. 2 1.3 PHYTOCHROM-ABHAENGIGE
SIGNALWEGE 8 1.4 EINE GENETISCHE METHODE ZUR IDENTIFIKATION VOM
PROTCIN-PROTEIN-WCCHSCLWIRKUNGEN: DAS TWO- HYBRID SYSTEM 11 1.5
UEBEREXPRESSION VON PHYTOCHROM 12 2 MATERIAL 14 2.1 ORGANISMEN 14 2.1.1
MOOS * 14 2.1.2 HEFESTAEMME , 14 2.1.3 BAKTERIENSTAEMME 15 2.2 PLASMIDC
UND PRIMER 16 2.2.1 PHYTOCHROM-GENE 16 2.2.2 PLASMIDE FUER DAS TWO-HYBRID
SYSTEM 17 2.2.3 PLASMIDE FUER DIE UEBEREXPRESSION 18 2.2.4 PRIMER 19 2.3
MEDIEN 19 2.3.1 MOOSKULTUR 19 2.3.2 HEFEKULTUR 21 2.3.3 BAKTERIENKULTUR
- 24 2.4 CHEMIKALIEN 26 2.5 ANTIKOERPER UND CHROMOPHORE 30 2.6 GERAETE UND
VERBRAUCHSMATERIAL 31 3 METHODEN 33 3.1 MOLEKULARE STANDARDMETHODEN 33
3.1.1 BAKTERIEN 33 3.1.1.1 KOMPETENTE ZELLEN 33 3.1.1.2
BAKTERIEN-TRANSFORMATION 34 3.1.1.3 PLASMIDPRAEPARATION 35 3. 3. 3. 3.1.1
3. 3. .3.1 *MINI -PLASMIDPRAEPARATION 35 .3.2 *MIDI -PLASMIDPRAPARATION
37 .3.3 *LARGE -PLASMIDPRAEPARATION 38 REINIGUNG UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER DNA 39 .4.1 SEPHADEX G50-SAEULE 40 .4.2
*GENECLEAN , 40 3.1.1.4.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 41 3.1.2 KLONIERUNG
42 3.1.2.1 PCR 42 3.1.2.2 RESTRIKTIONSVERDAU 43 3.1.2.3 ANDERE
ENZYMATISCHE MODIFIKATIONEN 43 3.1.2.4 LIGATION 44 3.1.2.5
ELEKTROPHORESE 45 3.1.3 HEFEN 47 3.1.3.1 TRANSFORMATION 47 3.1.3.2
*CARRIER DNA 49 3.1.3.3 *DOTTEN AUF FESTMEDIUM 50 3.1.3.4
PLASMIDPRAEPARATION 52 3.2 PROTEINCHEMISCHE STANDUERDMETHODCN 52 3.2.1
SDS-PAGE 52 3.2.2 COOMASSIE-FAERBUNG 55 3.2.3 WESTERNBLOT 56 3.2.4
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 57 3.3 CDNA-BANK 58 3.3.1 PFLANZENMATERIAL 58
3.3.2 RNA-LSOLATION 58 3.3.3 ISOLATION VON POLY(A)* MRNA AUS GESAMT-RNA
60 3.3.4 CDNA-SYNTHESE * 61 3.3.5 LIGATION DER CDNA-SSANK IN DEN
BAKTERIENVEKTOR 65 3.3.6 AMPLIFIKATION IN E. COLI 66 3.4 TWO-LLYHRID
SYSTEM 67 3.4.1 KLONIERUNG DER KOEDER 67 3.4.2 EIGNUNGSTESTS DER KOEDER 68
3.4.2.1 AKLIVIERUNGSTEST 69 3.4.2.2 UEPRCSSORTEST 70 3.4.2.2.1
FARBREAKTION AUF FESTMEDIUIN 71 3.4.2.2.2 SS-GALACTOSIDASE-TEST MIT ONPG
71 3.4.3 DIE SICHTUNG: DAS TWO-HYBRID SYSTEM 73 3.4.3.1 TRANSFORMATION
DER BANK 73 3.4.3.2 AMPLIFIKATION - 74 3.4.3.2.1 AMPLIFIKATION AUF
FESTMEDIUM 74 3.4.3.2.2 AMPLIFIKATION IN FLUESSIGMEDIUM 74 3.4.3.3
SELEKTION 75 3.4.4 GENETISCHE ANALYSE DER POSITIVEN KLONE 76 3.5
UEBEREXPRESSION VON PHYTOCHROM IN HEFE 77 3.5.1 KLONIERUNG DER
EXPRESSIONSVEKTOREN 77 3.5.2 EXPRESSION IN HEFE 78 3.5.3 REKOMBINATION
IN VITRO 80 3.5.4 LASER-ANGEREGLE PHOTOLYSE 81 3.6 UEBEREXPRESSION DER
INTERAKTOREN IN E. COLI 82 3.6.1 EXPRESSION IN E. COLI 82 1 (* 7
AIIFICINIWIIIK MIT (!HILALHIIIN-SC|IHIIR J.7 WECHSELWIRKUNG IN VITRO M
3.7.1 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 84 3.7.2 PHOSPHORYLIERUNGSVERSUCHE 85 4
ERGEBNISSE 87 4.1 ERSTELLEN EINER CDNA-BANK AUS CERATODON PURPUREUS 87
4.1.1 CDNA-SYNTHESE 87 4.1.2 KLONIERUNG DER CDNA-FRAGMENTE IN DEN
PLASMID-VEKTOR PJG4-50 90 4.1.3 ANLEGEN EINER PHAGENBANK 93 4.2 DIE
KOEDER FUER DIE SICHTUNGEN 93 4.2.1 KLONIERUNG DER KOEDER AUS
PHYTOCHROM-SEQUENZEN 94 . 4.2.2 ZWEI EIGNUNGSTESTS FUER DIE KOEDER 98
4.2.2.1 DER AKTIVIERUNGSTEST SCHLIESST EIGENAKTIVIERUNG AUS 99 4.2.2.1.1
U?-SELEKTIONAUFFESTMEDIUM 100 4.2.2.1.2 LOCZ-REAKTION IM
ONPG-ENZYMTEST 102 4.2.2.2 DER REPRESSORTEST BEWEIST DIE BINDEFAEHIGKEIT
AN DEN PROMOTOR 103 4.2.2.3 FOLGERUNGEN FUER DIE EIGNUNG DER KOEDER 107
4.3 VERLAUF DER SICHTUNGEN 107 4.3.1 SICHTUNG IT5 III 4.3.1.1 STUFE 1:
DIE SICHTUNG III 4.3.1.2 STUFE 2: ERNEUTE SELEKTION NACH DER SICHTUNG
112 4.3.1.3 STUFE 3: DIE RETRANSFORMATION 114 4.3.1.3.1 L/2-REAKTION
AUF FESTMEDIUM 115 4.3.1.3.2 IACZ-REAKTION IM ONPG-ENZYMTEST 118 4.3.2
DIE POSITIVEN KLONE AUS ALLEN SICHTUNGEN 120 4.4 IN W/RE-VCRSUCHE MIT
DEN EXPRIMIERTEN PROTEINEN 122 4.4.1 UEBEREXPRESSION VON
PHYTOCHROM-APOPROTEIN IN HEFE 122 4.4.1.1 REKONSTITUTION VON
CPPHY2-APOPROTCIN MIT ZWEI VERSCHIEDENEN CHROMOPHOREN 124 4.4.1.2 TEST
AUF DUNKELREVERSION DES CPPHY2 127 4.4.1.3 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION
VON PHOTOAKTIVEM PHYTOCHROM 128 4.4.1.4 NACHWEIS VON GEBUNDENEM
CHROMOPHOR DURCH ZINK-FAERBUNG 129 4.4.1.5 LASERBLITZ-PHOTOLYSE 130 4.4.2
UEBEREXPRESSION DER MUTMASSLICHEN INTERAKTOREN IN BAKTERIEN 137 4.4.3
VERSUCHE ZUR IN VI/NJ-INTERAKTION DER EXPRIMIERTEN INTERAKTOR- UND
PHYTOCHROM-PROTEINE 139 4.4.3.1 GEMEINSAME AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE DER
PROTEINE UEBER GLULATHION-SEPHAROSC 140 4.4.3.2 KANN PHYTOCHROM ALS
PROTEIN-KINASE REAGIEREN? 140 4.4.3.3 AENDERUNG DER KINETIKEN NACH
LASERBLITZ-PHOTOLYSE 143 4.5 DAS CERFO(/N-*GENOM-PROJEKT 144 5
DISKUSSION 147 5.1 EXPRESSION UND REKONSTITUTION VON
CERAFTM/OFI-PHYTOCHROM 147 5.2 DIE SICHTUNGEN MIT DEM TWO-HYBRID SYSTEM
148 5.2.1 OPTIMIERUNG DER METHODE . 148 5.2.2 BEWERTUNG DER POSITIV
EINGESCHAETZTEN KLONE 150 5.2.2.1 IN DER SICHTUNG 150 5.2.2.2 IN DEN
PROTEINVERSUCHEN 152 5.3 ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER ERGEBNISSE UND
AUSBLICKE 154 6 ZUSAMMENFASSUNG 157 7 ANHANG 159 7.1 SEQUENZEN DER
CDNA-FRAGMENTE 159 7.2 LITERATURVERZEICHNIS 168 7.3 DANKSAGUNG 179 7.4
LEBENSLAUF 180
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