Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung von Kandidatengenen mit einer potentiellen Atherosklerose-Assoziation:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Regensburg, Univ., Diss., 1998 |
| Beschreibung: | [8], 217 Bl. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1.1 DIE PATHOGENESE DER ATHEROSKLEROSE 1
1.2 DAS MONONUKLEAER-PHAGOZYTAERE SYSTEM 4
1.2.1 HISTORISCHES 4
1.2.2 DIE MYELOPOESE 4
1.2.3 EIGENSCHAFTEN UND AUFGABEN DES MPS 5
1.2.3.1 MAKROPHAGEN-HETEROGENITAET 5
1.2.3.2 PHAGOZYTIERENDE MAKROPHAGEN
6
1.2.3.3 DENDRITISCHE ZELLEN 9
1.3 ATHEROGENE LIPOPROTEINE 10
1.3.1 LIPOPROTEIN (A) [LP(A)] 10
1.3.2 KLEINES, DICHTES (YYSMALL DENSE") LDL 11
1.3.3 YYADVANCED GLYCATION ENDPRODUCTS" (AGE)-MODIFIZIERTES LDL 11
1.3.4 ENZYMATISCH MODIFIZIERTES UND OPSONIERTES LDL 12
1.4 HIGH DENSITY LIPOPROTEIN (HDL) ALS ANTIATHEROGENES LIPOPROTEIN 12
1.4.1 APOLIPOPROTEINE DES HDL 12
1.4.1.1 A-APOLIPOPROTEINE 12
1.4.1.1.1 APOLIPOPROTEIN AI (APO AI) 12
1.4.1.1.2 APOLIPOPROTEIN AH (APO AH) 14
1.4.1.1.3 APOLIPOPROTEIN AIV (APO AIV) 15
1.4.1.2 C-APOLIPOPROTEINE 15
1.4.1.2.1 APOLIPOPROTEIN CI (APO CI) 15
1.4.1.2.2 APOLIPOPROTEIN CII (APO CII) 16
1.4.1.2.3 APOLIPOPROTEIN CIH (APO CIII) 17
1.4.1.2.4 APOLIPOPROTEIN CIV (APO CIV) 17
1.4.1.3 DAS AKUTPHASE-PROTEIN SERUM AMYLOID A (SAA) 17
1.4.1.4 SONSTIGE APOLIPOPROTEINE UND ENZYME DES HDL-PARTIKELS 19
1.4.2 DER HDL-STOFFWECHSEL 19
1.4.3 MECHANISMEN DER WECHSELWIRKUNG VON HDL MIT PERIPHEREN ZELLEN 22
1.4.3.1 YYAQUEOUS DIFFUSION-THEORIE" 22
1.4.3.2 DAS APOLIPOPROTEIN-BINDUNGSMODELL 23
1.4.3.2.1 APO
AI/HDL3
VERMITTELTER CHOLESTERINEFFLUX 24
1.4.3.2.2 APO AI/HDL
3
-VERMITTELTE SIGNALTRANSDUKTION 24
1.4.3.3 RETROENDOZYTOSE VON HDL
3
25
1.4.4 BEREITS KLONIERTE HDL-BINDENDE PROTEINE 26
1.4.4.1 YYHDL BINDING PROTEIN" (HBP) 26
1.4.4.2 DAS HDL-BINDENDE PROTEIN HB
2
27
1.4.4.3 YYSCAVENGER" REZEPTOR BI (SR-BI) 27
1.4.5 STRATEGIEN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON KANDIDATENGENEN BZW. -PROTEINEN
MIT EINER
POTENTIELLEN ATHEROSKLEROSE-ASSOZIATION 29
1.4.5.1 UNTERSUCHUNGEN DER
IN
VIVO-PHOSPHORYLIERUNG VON PROTEINEN 29
1.4.5.2 IDENTIFIZIERUNG DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER GENE 30
1.4.5.3 IDENTIFIZIERUNG APO AI (HDL)-BINDENDER PROTEINE MIT DEM
TWO-HYBRID SYSTEM 31
II. ZIELSETZUNG
34
III. MATERIAL
36
3.1 EUKARYONTISCHE ZELLINIEN
3^
3.2 BAKTERIEN
3^
3.3 HEFEN
36
3.4 DNA
36
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/955266769
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1 PLASMIDE
36
3.4.2 OLIGONUKLEOTIDE
36
3.4.3 DNA-MOLEKULARGEWICHTSTANDARDS
37
3.4.4 SONSTIGE DNA
37
3.5 RNA
37
3.6 CDNA-GENBANKEN
37
3.7 MARKERPROTEINE FUER SDS-PAGE
37
3.8 KITS
37
3.9 CHEMIKALIEN
3G
3.10 RADIOCHEMIKALIEN
38
3.11 ANTIKOERPER, BIOCHEMIKALIEN UND ENZYME
38
3.11.1 ANTIKOERPER
38
3.11.2 BIOCHEMIKALIEN
39
3.11.3 ENZYME
39
3.12 FILME UND MEMBRANEN 40
3.13 GERAETE
40
/
IV. METHODEN
41
4.1 ZELLKULTURTECHNIKEN 41
4.1.1 KULTIVIERUNG HUMANER MO 41
4.1.2 KULTIVIERUNG HUMANER TUMORZELLINIEN (HEPG2- UND HELA-ZELLEN) 42
4.1.3 KULTIVIERUNG VON SF9-INSEKTENZELLEN 42
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN 42
4.2.1 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN
{ESCHERICHIA COLI) 42
4.2.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN
43
4.2.2.1 AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSEGELEN 43
4.2.2.2 AUFTRENNUNG VON RNA IN AGAROSEGELEN
44
4.2.2.3 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN
44
4.2.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON CDNA-SONDEN
45
4.2.4 NUKLEINSAEURE-TRANSFER UND HYBRIDISIERUNG 46
4.2.4.1 NORTHERN BLOTTING 46
4.2.4.2 TRANSFER VON DNA AUS PHAGENPLAQUES AUF NYLON MEMBRANEN
(YYPLAQUELIFTS") 47
4.2.5 AUTORADIOGRAPHIE 48
4.2.6 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 48
4.2.6.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 48
4.2.6.2 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA 49
4.2.6.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 49
4.2.6.4 ISOLIERUNG VON LAMBDA-DNA 50
4.2.7 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 50
4.2.7.1 ENZYMATISCHE SPALTUNG VON DNA 50
4.2.7.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID-DNA 51
4.2.7.3 PRAEPARATION VON INSERT-DNA I (YYBLUNT END"-KLONIERUNG VON
PCR-PRODUKTEN OHNE
KUENSTLICH EINGEFUEGTE RESTRIKTIONSENDONUKLEASE-SCHNITTSTELLEN) 51
4.2.7.4 PRAEPARATION VON INSERT-DNA II (KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN MIT
KUENSTLICH
EINGEFUEGTEN RESTRIKTIONSENDONUKLEASE-SCHNITTSTELLEN) 52
4.2.7.5 LIGATION 53
4.2.8 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN KOMPETENTE
E.COLI-ZELLEN 53
4.2.8.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER
E.COLI-ZEWEN 53
4.2.8.2 TRANSFORMATION 54
4.2.8.3 ANALYSE DER TRANSFORMANDEN 55
4.2.9 FLUORESZENZSEQUENZIERUNG 55
4.2.9.1 SEQUENZIERREAKTION 56
4.2.9.2 POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE (SEQUENZIERGEL) 57
4.2.10 REVERSE TRANSKRIPTION (RT) VON MRNA 57
4.2.11 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 58
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.11.1 AMPLIFIKATION GENOMISCHER DNA MIT DEM EXPAND
YY
HIGH FIDELITY PCR SYSTEM 59
4.2.11.2 5'-RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS (5'-RACE-PCR) 60
4.2.11.3 PROMOTOR KLONIERUNG MIT DEM PROMOTORFINDER
YY
DNA WALKING KIT 61
4.2.12 METHODEN ZUM ARBEITEN MIT LAMBDA-PHAGEN 63
4.2.12.1 ANZUCHT DER WIRTSBAKTERIEN 63
4.2.12.2 INFEKTION DER WIRTSZELLEN 63
4.2.12.3 AUSPLATTIEREN DER PHAGEN 63
4.2.12.4 ERMITTLUNG DES PHAGENTITERS 63
4.2.12.5 GENBANKSCREENING 63
4.2.13 LUCIFERASE REPORTERGEN ASSAYS ZUR BESTIMMUNG VON
PROMOTORAKTIVITAETEN 64
4.2.13.1 KLONIERUNG DER LUCIFERASE-KONSTRUKTE 64
4.2.13.2 TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 65
4.2.13.3 LUCIFERASE ASSAY 65
4.2.14 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE 66
4.2.14.1 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN EINEM PROKARYONTISCHEN
SYSTEM 66
4.2.14.2 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM 67
4.2.14.2.1 KLONIERUNG DES1 EXPRESSIONSKONSTRUKTES 67
4.2.14.2.2 KOTRANSFEKTION VON VIRUS-DNA UND PLASMID-DNA 67
4.2.14.2.3 PLAQUE ASSAY 67
4.2.14.2.4 ANALYSE DES TRANSFEKTIONSERFOLGES MITTELS PCR 68
4.2.14.2.5 INFEKTION VON INSEKTENZELLEN 68
4.2.15 FLUORESZENZ
IN SITU HYBRIDISIERUNG (FISH) 68
4.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 69
4.3.1 AUFTRENNUNG UND ELEKTROELUTION VON PROTEINEN 69
4.3.1.1 SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE(SDS-PAGE) 69
4.3.1.2 ZWEIDIMENSIONALE-ELEKTROPHORESE (2D-ELEKTROPHORESE) 70
4.3.1.3 ELEKTROELUTION VON PROTEINEN AUS SDS-GELEN 72
4.3.2 PROTEINFAERBUNG 72
4.3.2.1 COOMASSIE-FAERBUNG 72
4.3.2.2 SILBERFAERBUNG NACH HEUKESHOVEN UND DEMICK 72
4.3.3
IN V/TRO-TRANSLATION IM KANINCHEN RETIKULOZYTEN-LYSAT SYSTEM 73
4.3.4 RIBONUKLEASE (RNASE)-ASSAY 75
4.3.5 REINIGUNG DES REKOMBINANTEN P 14,5 MIT
METALL-CHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 75
4.3.6 ENTEROKINASE-VERDAU DES REKOMBINANTEN P 14,5-PROTEINS 76
4.3.7 GEWINNUNG VON ZELLORGANELLEN (SUBZELLULAERE FRAKTIONIERUNG) 77
4.3.7.1 SUBZELLULAERE FRAKTIONIERUNG VON RATTENLEBER 77
4.3.7.2 GEWINNUNG VON ZYTOSOL AUS MO/MO UND VERSCHIEDENEN GEWEBEN 77
4.3.8 PROTEINBESTIMMUNG NACH SMITH 78
4.3.9 PRAEPARATION VON LIPOPROTEINEN 78
4.3.10 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON HDL
3 MIT 125IOD 79
4.3.11 INKUBATION VON SF9-ZELLEN MIT
I25IOD-HDL3 79
4.4 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 80
4.4.1 IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN MIT REKOMBINANTEM PL4,5 80
4.4.2 WESTERN BLOTTING 80
4.4.3 IMMUNPRAEZIPITATION AUS RADIOAKTIV MARKIERTEN ZELLKULTUREN 81
4.4.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 82
4.4.5 LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE IMMUNHISTOCHEMIE 83
4.5 TWO-HYBRID SYSTEM 84
4.5.1 KULTIVIERUNG VON HEFEN 84
4.5.2 VERIFIZIERUNG DES PHAENOTYPS DES VERWENDETEN HEFESTAMMS Y190 85
4.5.3 KLONIERUNG VON APO AI IN DAS DNA-BD-PLASMID PAS2-1 86
4.5.4 AMPLIFIKATION DER TWO-HYBRID CDNA-GENBANK 87
4.5.5 HERSTELLUNG KOMPETENTER HEFEZELLEN 88
4.5.6 TRANSFORMATION 89
4.5.7 IDENTIFIZIERUNG VON WECHSELWIRKUNGEN DURCH REPORTERGENAKTIVIERUNG
90
4.5.7.1 AKTIVIERUNG DES ///53-REPORTERGENS (WACHSTUMSSELEKTION) 90
INHALTSVERZEICHNIS
4.5.7.2 AKTIVIERUNG DES LACZ-REPORTERGENS (FARBSELEKTION) 91
4.5.8 VORVERSUCHE ZUR TESTUNG DES APO AI-DNA-BD-PLASMIDS (APO AI-PAS2-L)
92
4.5.9 SCREENING EINER TWO-HYBRID CDNA-GENBANK 93
4.5.10 PLASMIDISOLIERUNG AUS HEFE 93
4.5.11 SELEKTION DES FUER DAS GENBANKPROTEIN KODIERENDEN AD-PLASMIDS
PACT-2 94
4.5.12 KONTROLLEXPERIMENTE MIT DEN ISOLIERTEN AD-PLASMIDEN 95
V. ERGEBNISSE
5.1 CHARAKTERISIERUNG DES NIEDERMOLEKULAREN PROTEINS P 14,5 96
5.1.1 EXPERIMENTELLE AUSGANGSSITUATION 96
5.1.2 KLONIERUNG DER CDNA 97
5.1.2.1 GENERIERUNG EINER CDNA-SONDE FUER DAS SCREENING EINER
CDNA-GENBANK 97
5.1.2.2 SCREENING EINER HUMANEN AGTL 1 LEBER-CDNA-GENBANK 98
5.1.2.3 KLASSIFIZIERUNG DER ^.-PHAGEN UND ISOLIERUNG DER
GENBANK-CDNA-INSERTS 98
5.1.2.4 STRUKTUR DER SEQUENZIERTEN CDNA 100
5.1.2.5 HOMOLOGIEN ZY ANDEREN GENEN 102
5.1.3 UEBEREXPRESSION VON PL4,5 IN
E.COLI UND REINIGUNG DES REKOMBINANTEN PROTEINS 105
5.1.4 GEWINNUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN REKOMBINANTES P 14,5
106
5.1.5 GEWEBE-SPEZIFISCHE EXPRESSION DER P 14,5-MRNA 106
5.1.6 DIFFERENZIERUNGSABHAENGIGE EXPRESSION IN MO/MO 108
5.1.7 INHIBITION DER
IN V/RRO-PROTEINBIOSYNTHESE DURCH REKOMBINANTES PL4,5 110
5.1.8 ELEKTROPHORETISCHE CHARAKTERISIERUNG DES PROTEINS 112
5.1.9 UNTERSUCHUNG DES
IN VIVO-PHOSPHORYLIERUNGSZUSTANDES VON PL4,5 113
5.1.10 IDENTIFIZIERUNG DER SUBZELLULAEREN LOKALISATION VON PL4,5 114
5.1.11 IMMUNHISTOCHEMISCHE DETEKTION VON PL4,5 IN HUMANEN GEWEBEN UNTER
NUTZUNG
VON LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE 115
5.1.11.1 LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG GESUNDER UND
PATHOLOGISCH-VERAENDERTER
BLUTGEFAESSE 115
5.1.11.2 LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG VON SCHMIERPRAEPARATEN
PERIPHERER
LEUKOZYTEN UND BRONCHO-ALVEOLAR-LAVAGE 116
5.1.11.3 LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG GESUNDER UND
PATHOLOGISCH-VERAENDERTER LEBER 116
5.1.11.4 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG GESUNDER LEBER 116
5.1.11.5 LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG GESUNDER UND
PATHOLOGISCH-VERAENDERTER NIERE 117
5.1.12 IDENTIFIZIERUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTES VON PL4,5 121
5.1.13 CHARAKTERISIERUNG DER PROMOTORREGION DES NIEDERMOLEKULAREN
PROTEINS PL4,5 122
5.1.13.1 KLONIERUNG DES PROMOTORS 122
5.1.13.2 STRUKTUR DES P 14,5-PROMOTORS 123
5.1.13.3 STRUKTUR DES HPOPL-PROMOTORS 125
5.1.13.4 KLONIERUNG DER PROMOTOR-LUCIFERASE KONSTRUKTE FUER P 14,5 127
5.1.13.5 BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DES P 14,5-PROMOTORS 127
5.1.13.6 KLONIERUNG DER PROMOTOR-LUCIFERASE KONSTRUKTE FUER HPOP 1 129
5.1.13.7 BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DES HPOPL -PROMOTORS 129
5.1.14 BESTIMMUNG DER CHROMOSOMALEN LOKALISATION 131
5.1.15 IDENTIFIZIERUNG EINES GENS MIT HOMOLOGIE ZU P 14,5 132
5.2 IDENTIFIZIERUNG UND KLONIERUNG POTENTIELLER APO AI (HDL)-BINDENDER
PROTEINE
UNTER NUTZUNG DES HEFE TWO-HYBRID SYSTEMS 134
5.2.1 GENERIERUNG DES APO AI-DNA-BD-PLASMIDS 134
5.2.2 TESTUNG DES APO AI-DNA-BD-PLASMIDS 134
5.2.3 AMPLIFIKATION DER TWO-HYBRID CDNA-GENBANK 135
5.2.4 SCREENING EINER TWO-HYBRID CDNA-GENBANK MIT DEM APO
AI-DNA-BD-PIASMID 136
5.2.5 ISOLIERUNG DER CDNA-GENBANK-PACT2-PLASMIDE 139
5.2.6 SEQUENZIERUNG DER GENBANK-CDNA-INSERTS 140
5.2.7 KONTROLLEXPERIMENTE MIT DEN ISOLIERTEN PACT2-PLASMIDEN 141
5.2.8 STRUKTUR UND EIGENSCHAFTEN DER FALSCH-POSITIVEN HEFE-KLONE 141
5.2.9 POSITIVE KLONE MIT BEKANNTER HDL-ASSOZIATION 144
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.9.1 SERUM AMYLOID
A2A
5.2.9.2 APOLIPOPROTEIN CI
5.2.10 DER ZELLOBERFLAECHENREZEPTOR CD99 (MIC2, E2)
5.2.10.1 STRUKTUR DER IDENTIFIZIERTEN CD99-KLONE
5.2.10.2 EUKARYONTISCHE EXPRESSION VON CD99 (BACULOVIRUS-SYSTEM)
5.2.10.3 BINDUNGSSTUDIEN MIT ,25I-HDL3
5.2.10.4 IDENTIFIZIERUNG DER APO AI-BINDENDEN DOMAENE DES CD99-MOLEKUELS
5.2.11 UNBEKANNTE (NICHT PUBLIZIERTE) POSITIVE TWO-HYBRID KLONE
5.2.11.1 KLON 1/12
5.2.11.2 KLON 7/5 UND 5/18
5.2.11.3 KLON 4/16
5.2.12 DIE PHOSPHODIESTERASE HCAML (PDE1A3)
144
144
144
144
144
147
150
152
152
155
158
161
VI. DISKUSSION
162
6.1
6
.
1.1
6
.
1.2
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6
.
1.6
6.1.7
6
.
1.8
6.1.9
6
.1.10
6.1.11
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.3.1
6.2.3.2
6.2.3.3
6.2.4.
6.2.4.1
6.2.4.2
6.2.5
6.2.5.1
6.2.5.2
CHARAKTERISIERUNG DES DIFFERENZIERUNGSABHAENGIG REGULIERTEN PROTEINS P
14,5 162
ALLGEMEINE BETRACHTUNGEN 152
STRUKTUR DER PL4,5-CDNA UND DES VON IHR KODIERTEN PROTEINS 163
HOMOLOGIEN VON PL4,5 ZU ANDEREN PROTEINEN 165
FUNKTION VON P 14,5 ALS POTENTIELLER INHIBITOR DER PROTEINBIOSYNTHESE
166
IST PL4,5 EIN HITZESCHOCKPROTEIN (HSP)? 167
IST PL4,5 EIN TUMOR-SPEZIFISCHES ZELLOBERFLAECHENANTIGEN? 168
GEWEBEVERTEILUNG UND DIFFERENZIERUNGSABHAENGIGE EXPRESSION VON P 14,5 169
STRUKTUR DES PL4,5-PROMOTORS 171
IDENTIFIZIERTE TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLEN MIT POTENTIELLER
BEDEUTUNG FUER
DIE DIFFERENZIERUNG VOM MO ZUM MO 172
WEITERE POTENTIELL BEDEUTSAME TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLEN 172
EIN BIDIREKTIONALER PROMOTOR VERBINDET P!4,5 MIT HPOPL 173
KLONIERUNG APO AI (HDL)-BINDENDER PROTEINE MIT DEM HEFE TWO-HYBRID
SYSTEM 175
ALLGEMEINE BETRACHTUNGEN 175
FALSCH-POSITIVE HEFE-KLONE I75
DER ZELLOBERFLAECHENREZEPTOR CD99 177
EUKARYONTISCHE EXPRESSION VON CD99 178
BINDUNGSSTUDIEN MIT
125I-HDL3 178
APO AI INTERAGIERT UNSPEZIFISCH MIT DER TRANSMEMBRANDOMAENE VON CD99 179
PROTEINE MIT BEKANNTER HDL-ASSOZIATION 180
APOLIPOPROTEIN CI 180
SERUM AMYLOID
A2A 181
PROTEINE OHNE BEREITS BEKANNTE HDL-ASSOZIATION 181
DIE PHOSPHODIESTERASE HCAM 1 181
UNBEKANNTE CDNAS 183
VII. ZUSAMMENFASSUNG
185
7.1 CHARAKTERISIERUNG DES NIEDERMOLEKULAREN PROTEINS P 14,5 185
7.2 IDENTIFIZIERUNG UND KLONIERUNG POTENTIELLER APO AI (HDL)-BINDENDER
PROTEINE 187
VIII. LITERATUR
190
IX. ANHANG
216 |
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