Funktionelle Analyse des Glutamattransporters GLAST-1 in vivo: Anwendung der gene targeting Technologie zur Erstellung transgener Mausmodelle
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1998
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1
1
EINLEITUNG
1.1
DIE
GLUTAMATERGE
SYNAPSE
1
1.2
GLUTAMATTRANSPORT
IM
NERVENSYSTEM
3
1.3
DIE
GLUTAMATTRANSPORTER-FAMILIE
4
1.4
GLUTAMAT
UND
GEDAECHTNISBILDUNG
5
1.5
GLUTAMAT
UND
NEURODEGENERATION
6
1.6
TRANSGENE
MAUSMODELLE
8
1.6.1
GENE
TARGETING
8
1.6
2
KONDITIONALES
GENE
TARGETING
10
2
AUFGABENSTELLUNG
14
3
ERGEBNISSE
15
3.1
ERZEUGUNG
EINER
TRANSGENEN
MAUSLINIE
ZUM
KONDITIONALEN
AUSSCHALTEN
DES
GLAST-1-GENS
15
3.1.1
GLAST-1FLOX
TARGETING
KONSTRUKT
15
3.1.2
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
17
3.1.3
TRANSIENTE
CRE-EXPRESSION
19
3.1.4
BLASTOZYSTENINJEKTION
UND
ETABLIERUNG
DER GLAST-1FLOX
MAUSLINIE
22
3.1.5
VON
DER
GLAST-1FLOXZUR
KONDITIONAL
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
23
3.1.5.1
EINKREUZEN
DER
CRE-REKOMBINASE
MAUSLINIE
24
3.1.5.2
DIE
TRANSAKTIVATOR
MAUSLINIE
24
3.2
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
GLAST-1
FLOX
MAUSLINIE
27
3.2.1
ANALYSE
AUF
DNA-,
RNA
UND
PROTEINEBENE
27
3.2.2
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
VON
ASTROZYTEN
31
3.2.3
PHAENOTYP
DER
GLAST-1
REDUZIERTEN
TIERE
33
3.2.4
14
C-GLUTAMATAUFNAHME
IN
SYNAPTOSOMEN
33
3.2.5
14
C-GLUTAMATAUFNAHME
IN
ASTROZYTEN
34
3.3
ANALYSE
DER
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
35
3.3
1
KNOCKOUT
TARGETING
KONSTRUKT
35
3.3.2
GENOTYP
DER
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
36
3.3.3
PHAENOTYP
DER
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
36
3.3.4
GLUTAMATTRANSPORTER-EXPRESSION
AUF
RNA-EBENE
36
3.3.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEIN-EXPRESSION
38
3.3.6
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
VON
ASTROZYTEN
39
3.3.7
HISTOLOGIE
42
3.3.8
IMMUNHISTOCHEMIE
43
3.3.9
APOPTOSE-ASSAY
3.3
10
4
C-GLUTAMATAUFNAHME
IN
SYNAPTOSOMEN
45
45
3.3.11
14
C-GLUTAMATAUFNAHME
IN
ASTROZYTEN
47
3.3.12
INDUCED
SEIZURE
48
3.3.13
VERHALTENSEXPENMENTE
49
3.3.13.1
MORRIS
WATER
MAZE
TEST
49
3.3.13.2
OPENFIELDTEST
51
3.3.13.3
DESCENDING
POLE
TEST
52
3.3.13.4
INCLINED
GRID
TEST
53
3.3.13.5
HORIZONTAL
WIRE
/
HORIZONTAL
BRIDGE
TEST
54
4
ZUSAMMENFASSUNG
56
5
DISKUSSION
57
5.1
DIE
GLAST-1FLOX
MAUSLINIE
ZUM
KONDITIONALEN
AUSSCHALTEN
DES
GLAST-1-GENS
57
5.1.1
GENE
TARGETING
57
5.1.2
TRANSIENTE
CRE-EXPRESSION
57
5.1.3
GENERIERUNG
DER
TRANSGENEN
GLAST-1FLOX
MAUSLINIE
58
5.1.4
REDUZIERTE
GLAST-1
EXPRESSION
DER
GLAST-1FLOX
MAUSLINIE
58
5.1.5
GLUTAMATAUFNAHME
DER
GLAST-1
REDUZIERTEN
MAUSLINIE
59
5.1.6
INDUZIERBARE
GLAST-1
NULLMUTATION
59
5.2
DIE
GLAST-1
DEFIZIENTE
MAUSLINIE
60
5.2.1
GENE
TARGETING
60
5.2.2
GLAST-1
DEFIZIENZ
61
5.2.3
HISTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAEUSE
61
5.2.4
GLUTAMATTRANSPORT
61
5.2.5
GLAST-1
DEFIZIENZ
UNTER
EXZITOTOXISCHEN
BEDINGUNGEN
62
5.2.6
VERHALTENSTESTS
DER
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAEUSE
62
5.2.7
HYPOTHESEN
UND
ANALYSEN
UEBER
DIE
GLUTAMATTRANSPORTER
63
5.2.8
AUSSAGEN
DES
GLAST-1
DEFIZIENTEN
MAUSMODELLS
64
6
MATERIAL
UND
METHODEN
66
6.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
66
6.1.1
DNA-PRAEPARATION
66
6.1.2
ENZYMATISCHE
DNA-RESTRIKTION
66
6.1.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
66
6.1.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
67
6.1.5
SOUTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
67
6.1.6
KLONIERUNG
DER
VEKTOREN
ZUR
TRANSAKTIVATOR
EXPRESSION
67
6.1.7
RNA
PRAEPARATION
AUS
GEWEBE
67
6.1.8
NORTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
68
6.1.9
POLYMERASE
KETTEN
REAKTION
(PCR)
68
6.2
PROTEINCHEMISCHE,
IMMUNOLOGISCHE
UND
HISTOLOGISCHE
METHODEN
68
6.2.1
PROTEINPRAEPARATION
/
SYNAPTOSOMENPRAEPARATION
68
6.2.2
WESTERN
BLOT
69
6.2.3
IMMUNHISTOCHEMIE
/
HISTOLOGIE
/
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
69
6.2.4
APOPTOSE-ASSAY
69
6.2.5
14
C-GLUTAMATAUFNAHME
VON
SYNAPTOSOMEN
70
6.3
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
70
6.3.1
KULTUR
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
70
6.3.2
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
70
6.3.3
TRANSFEKTION
EMBRYONALER
STAMMZELLEN
70
6.3.4
PRAEPARATION
VON
ASTROZYTEN
71
6.3.5
14
C-GLUTAMATAUFNAHME
VON
ASTROZYTEN
71
6.4
METHODEN
ZUR
ERZEUGUNG
TRANSGENER
MAEUSE
71
6.4.1
BLASTOZYSTENSPENDER
71
6.4.2
BLASTOZYSTENISOLATION
72
6.4.3
BLASTOZYSTENINJEKTION
72
6.4.4
VASEKTOMIERTE
MAENNCHEN
72
6.4.5
REIMPLANTATION
VON
BLASTOZYSTEN
IN
SCHEINSCHWANGERE
FOSFER-MUETTER
72
6.5
INDUCED
SEIZURE
72
6.6
TIEREXPERIMENTELLE
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
VERHALTEN
72
6.6.1
MONIS
WATER
MAZE
TEST
73
6.6.2
OPENFIELD
TEST
73
6.6.
3
DESCENDING
VERTICAL
POLE
TEST
73
6.6.4
HORIZONTAL
WIRE
TEST
73
6.6.5
HORIZONTAL
BRIDGE
TEST
73
6.6.6
INCLINEDGRID
TEST
74
7
ANHANG
75
7.1
SEQUENZEN
DER
PCR-PRIMER
75
7.2
ABKUERZUNGEN
75
8
LITERATUR
71 |
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