Untersuchungen zur Interaktion zwischen Gal1p und Gal80p während der Induktion des Galaktoseregulons in Hefe:
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| Sprache: | German |
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN 10
2.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 10
2.2 HEFESTAEMME 10
2.2.1 MEDIEN FUER HEFESTAEMME 11
2.2.2 LAGERUNG DER HEFESTAEMME 12
2.3 BAKTERIENSTAEMME 12
2.3.1 MEDIEN FUER BAKTERIENSTAEMME 12
2.3.2 LAGERUNG DER BAKTERIENSTAEMME 12
2.4 PLASMIDE 13
2.5 TRANSFORMATION 18
2.5.1 TRANSFORMATION VON
E. COLI 18
2.5.2 HEFETRANSFORMATION 18
2.5.3 ZELLKOLONIE-TRANSFORMATION 19
2.6 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 19
2.6.1 PLASMID-DNA-PRAEPARATION AUS
E. COLI 19
2.6.2 PLASMID-DNA-PRAEPARATION AUS HEFE (MICROHIRT) 20
2.7 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 20
2.7.1 SPEKTRALPHOTOMETRISCHE MESSUNG 20
2.7.2 ABSCHAETZUNG DER KONZENTRATION AUS AGAROSEGELEN 20
2.8 ENZYMATISCHE MODIFIKATION DER DNA 21
2.8.1 DNA-RESTRIKTION 21
2.8.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 21
2.8.3 KLENOW-AUFFUELLUNG ZURUECKLIEGENDER 3'-ENDEN 21
2.8.4 RANDOM PRIMED DNA-MARKIERUNG MIT DIGOXIGENIN-DUTP 22
2.8.5 DNA-LIGATION 22
2.9 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN 22
2.10 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 23
2.11 SEQUENZIERUNG VON DNA 23
2.12 AMPIIFIZIERUNG VON DNA MITTELS PCR 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.13 SPEZIFISCHER NACHWEIS VON DNA-SEQUENZEN (SOUTHERN BLOT) 24
2.14 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS HEFE 24
2.14.1 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN FUER WESTERN-ANALYSEN 24
2.14.2 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN FUER SS-GALAKTOSIDASE-ENZYMTEST 25
2.14.3 HERSTELLUNG VON PROTEINROHEXTRAKTEN FUER A-GALAKTOSIDASE-ENZYMTEST
25
2.15 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 25
2.16 BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET 25
2.16.1 TEST MIT FLUESSIGKULTUREN 25
2.16.2 X-GAL FILTERTEST 26
2.17 BESTIMMUNG DER A-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET 26
2.17.1 PLATTENTEST 26
2.17.2 TEST MIT FLUESSIG KULTUREN 27
2.18 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 27
IN SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
2.19 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN (WESTERN BLOT) 28
2.20 ZUFALLSGERICHTETE MUTAGENESE VON DNA MITTELS 28
HYDROXYLAMIN
2.21 STABILITAETSTEST VON PLASMIDEN 28
2.22 (PULSE)-CHASE EXPERIMENTE UND IMMUNOPRAEZIPITATION (NATIV UND
DENATURIEREND) 29
2.22.1 CHASE FUER NATIVE IMMUNOPRAEZIPITATION 29
2.22.2 NATIVE IMMUNOPRAEZIPITATION 29
2.22.3 PULSE CHASE FUER IMMUNOPRAEZIPITATION DENATURIERTER PROTEINE 30
2.22.4 IMMUNOPRAEZIPITATION DENATURIERTER PROTEINE 30
3 ERGEBNISSE 31
3.1 ISOLIERUNG DOMINANTER REGULATORISCHER
KIGALI MUTANTEN 31
3.2 LOKALISIERUNG DER MUTATIONSORTE DER REGULATORISCHEN MUTANTEN
GAL1 -DS/4/5/6/8 32
3.2.1 EINGRENZUNG DER MUTATIONSORTE 32
3.2.2 SEQUENZIERUNG DER MUTANTENALLELE
GALL-D3 4 5/6/8 33
3.2.3 AUSSCHLIESSEN EINER WEITEREN MUTATION IM
GAL 1-GAL 10 PROMOTOR 33
3.3 INDUKTIONSVERHALTEN DER
GALL-D MUTANTE 34
3.4 NACHWEIS DER DOMINANZ DES
GALL-D UEBER DAS WILDTYP ALLEL 35
3.5 FUEHRT DAS
GALL-D ALLEL IN EINEM SUPERREPRIMIERTEN K. LACTIS 36
STAMM WIEDER ZUR INDUKTION?
3.6
GAL1 EXPRESSION IN VERSCHIEDENEN K. LACTIS STAEMMEN 37
3.7 SEQUENZVERGLEICH VON KIGALLP MIT GAL3P UND GAILP AUS 38
VERSCHIEDENEN ORGANISMEN
3.8 INDUKTIONSVERHALTEN DER REGULATORISCHEN
KIGALI MUTANTEN- 41
ALLELE IN
S. CEREVISIAE
3.8.1 DISRUPTION DES
GAL3 IM S. CEREVISIAE STAMM OTMZ4 41
3.8.2 KLONIERUNG DER REGULATORISCHEN KIGALI MUTANTENALLELE IN 42
S. CEREVISIAE
VEKTOREN
3.8.3 MESSUNG DER A-GALAKTOSIDASE AKTIVITAET 42
3.9 UEBEREXPRESSION DER REGULATORISCHEN GAILP MUTANTEN IN 43
K. LACTIS
3.9.1 KLONIERUNG DER REGULAETORISCHEN
KIGALI MUTANTEN IN EINEN 43
MULTICOPY VEKTOR
3.9.2 MESSUNG DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET 43
3.10 BESTIMMUNG DER GAILP HALBWERTSZEIT 45
3.11 NACHWEIS DES GALL-GAL80P KOMPLEXES 46
3.11.1 GAL 1 P UND GAL80P KOENNEN NICHT ZUSAMMEN KOPRAEZIPITIERT WERDEN 46
3.11.2 NACHWEIS DES GALL-GAL80P KOMPLEXES UEBER TWO-HYBRID ANALYSEN 48
3.11.2.1 ETABLIERUNG EINES GEEIGNETEN TWO-HYBRID SYSTEMS 48
3.12 DIE REGULATORISCHE FUNKTION DES KIGALLP WIRD UEBER DESSEN 50
INTERAKTION MIT GA!80P VERMITTELT
3.13 TWO-HYBRID DELETIONSANALYSE DES
KIGALI 51
3.13.1 KONSTRUKTION C-TERMINALER
GAL/-DELETIONEN 51
3.13.2 EXPRESSION DER VERKUERZTEN GAL 1 P 52
3.13.3 TESTEN DER VERKUERZTEN GAILP IM TWO-HYBRID-SYSTEM MIT 52
VP16-GAL80P
3.13.4 WEITERE ANALYSE DER AKTIVIERENDEN DOMAENE (AS 1-99) DES GAILP 54
3.14 TWO-HYBRID SYSTEME ZUR LOKALISIERUNG DES GAILP-GAI80P 55
KOMPLEXES IN DER ZELLE
3.14.1 NACHWEIS EINES GAL 1 P-GAL80P-GAL4P DREIERKOMPLEXES IN 56
S. CEREVISIAE
L40
3.14.2 AKTIVIERUNG EINES
K. LACTIS KIGAL4 DELETIONSSTAMMES DURCH 57
VP16-GAL 1 P
3.15 IST VP16-GALLP IN DER LAGE, EINE INDUKTION VON JA6/D1R/8S2 59
ZELLEN ZU VERMITTELN?
3.16 KANN GALLP DIMERISIEREN? 60
3.17 UNTERSUCHUNG DER GAILP-GAL80P SPEZIESSPEZIFITAET ZWISCHEN 61
K. LACTIS
UND S. CEREVISIAE
3.17.1 KONSTRUKTION VON KLGALL/GAL3P FUSIONSPROTEINEN 61
3.17.2 TESTEN DER HYBRIDPROTEINE AUF GALAKTOKINASEAKTIVITAET 62
3.17.3 TESTEN DER FUSIONSPROTEINE IM TWO-HYBRID-ASSAY 63
3.17.4 INDUKTIONSVERHALTEN DER FUSIONSPROTEINE 64
3.17.5 UEBEREXPRIMIERT ZEIGEN DIE KLGALL/GAL3P HYBRIDE EINEN
GAL3-PHAENOTYP 66
4 DISKUSSION 68
4.1 KIGALLP IST EIN POSITIVER REGULATOR DES LAKTOSE-METABOLISMUS 68
IN
K. LACTIS
4.2 DURCH DIE KIGALLP-DELETIONSANALYSE KONNTE KEINEGAL80P- 70
INTERAKTIONSDOMAENE EINGEGRENZT WERDEN, ABER INTERNE
AKTIVIERUNGSDOMAENEN
4.3 UEBEREXPRIMIERT ZEIGEN DIE
GALL-M ALLELE UNTERSCHIEDLICHE 71
PHAENOTYPEN
4.4
KIGALI-D BEWIRKT EINE KONSTITUTIVE INDUKTION DER LAC/GAL-GENT 71
IN
K. LACTIS
4.5 VERGLEICH DER GALAKTOSE-INDUKTION VON
K. LACTIS UND S. CEREVISIAE 73
4.6 DIE SPEZIESSPEZIFITAET DER GALLP-GAL80P INTERAKTION WIRD IN 74
K. LACTIS
DURCH DAS GESAMTE KIGALLP VERMITTELT
4.7 MODELL ZUR REGULATION DER
GAL-GENE 75
5 ZUSAMMENFASSUNG 79
6 LITERATURVERZEICHNIS 80
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
87 |
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