Enzymhemmung, Wirksamkeit und Verteilung freier und trägergebundener Radiosensibilisatoren: 3-Aminobenzamid- und 4-Amino-1,8-naphthalimid-Humanserumalbumin
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
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| Beschreibung: | VIII, 167 S. Ill., graph. Darst. |
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INAUGURAL - DISSERTATION
ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE
DER NATURWISSENSCHAFTLICH-MATHEMATISCHEN GESAMTFAKULTAET DER
RUPRECHT-KARLS- UNIVERSITAET HEIDELBERG
VORGELEGT VON
APOTHEKERIN ALEXANDRA SCHLICKER
AUS LANGEN
MAI 1998
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
TABELLENVERZEICHNIS VIII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IX
1 EINLEITUNG 1
1.1 BIOLOGISCHE STRATEGIEN ZUR VERBESSERUNG DER STRAHLENWIRKUNG 2 1.1.1
MOLEKULARE ZIELSTRUKTUREN ZUR MODULATION DER STRAHLENWIRKUNG 3 1.1.2
WECHSELWIRKUNG VON MEDIKAMENTEN MIT STRAHLUNG 4
1.2 STRUKTUR UND FUNKTION DER POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE 5
1.3 POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-INHIBITOREN 8
1.3.1 3-AMINOBENZAMID 12
1.3.2 4-AMINO-L,8-NAPHTHALIMID 13
1.4 TUMORGERICHTETER TRANSPORT 14
1.4.1 DRUG-CARRIER-SYSTEME 15
1.4.2 ALBUMIN ALS TRAEGERSYSTEM 16
1.4.3 AKTIVER TRANSPORT MIT GLUCOSE 18
1.5 FRAGESTELLUNG 19
2 MATERIALIEN UND METHODEN 20
2.1 MATERIALIEN 20
2.1.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 20
2.1.2 LOESUNGEN 20
2.1.3 ZELLKULTURBEDARF 21
2.1.4 ANTIKOERPER 23
2.1.5 FILMMATERIAL 24
2.1.6 GERAETE UND SONSTIGE VERBRAUCHSMATERIALIEN 24
2.2 SYNTHESEN UND RADIOAKTIVE MARKIERUNGEN 24
2.2.1 SYNTHESE VON 3-AMINOBENZAMID- UND 4-AMINO-1,8-NAPHTHALIMID-
ALBUMIN 24
2.2.2 MARKIERUNG VON ALBUMIN MIT RADIOAKTIVEM INDIUM 25
2.2.3 HERSTELLUNG VON 3- UND 4-HYDROXYBENZAMIDGLUCOSID 26
2.2.4 SYNTHESE VON 3-AMINO-N-2,2,2-TRIFLUORETHYLBENZAMID 27 2.3 ANALYTIK
DER ALBUMINKONJUGATE 27
2.3.1 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE (DC) 27
2.3.2 UV-SPEKTROSKOPIE 28
2.3.3 PROTEINBESTIMMUNG (BCA-METHODE) 28
2.3.4 GEL-DRUCK-CHROMATOGRAPHIE (GPC) 28
2.3.5 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 29
2.3.6 KAPILLARELEKTROPHORESE (CE) 29
2.4 ZELLKULTUR 29
2.4.1 STANDARDKULTIVIERUNG 29
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.2 MODIFIZIERTE KULTURBEDINGUNGEN 31
2.4.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 32
2.4.4 ERSTELLUNG VON WACHSTUMSKURVEN 33
2.4.5 BESTIMMUNG DER VERDOPPLUNGSZEITEN 33
2.5 NACHWEIS DER POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-AKTIVITAET IN VITRO 33
2.5.1 SILANISIERUNG VON OBJEKTTRAEGERN 33
2.5.2 IMMUNCYTOCHEMISCHER NACHWEIS VON POLY(ADP-RIBOSE) 34
2.5.3 ENZYMAKTIVIERUNG IN VITRO 34
2.5.4 POLYMERABBAUKINETIK 35
2.5.5 NACHWEIS DER POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-INHIBITION 35
2.6 TOXIZITAETSTESTS ALLER SUBSTANZEN IN UNTERSCHIEDLICHEN ZELLINIEN 35
2.6.1 PROLIFERATIONSTEST 36
2.6.2 MTT-TEST 37
2.6.3 KOLONIEBILDUNGSTEST (COLONY FORMING ASSAY) 37
2.7 BESTIMMUNG DER RADIOSENSIBILISIERUNG 38
2.7.1 BESTRAHLUNGSEINRICHTUNG 38
2.7.2 ERMITTLUNG VON ZELLUEBERLEBENSKURVEN 38
2.8 FLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN IN VITRO 41
2.9 METHODEN ZU DEN TIEREXPERIMENTELLEN STUDIEN 42
2.9.1 TIERE UND TIERHALTUNG 42
2.9.2 TUMORMODELLE 42
2.9.3 TUMORTRANSPLANTATION 43
2.9.4 TOETUNG, SEKTION, ORGANKONSERVIERUNG 43
2.10 PHARMAKOKINETISCHE UNTERSUCHUNGEN 44
2.10.1 GANZKOERPERSZINTIGRAPHIE 44
2.10.2 19 F-NMR-BILDGEBUNG 46
2.11 NACHWEIS DER POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-AKTIVIERUNG IN VIVO 47
2.12 THERAPIEVERSUCHE IN VIVO 47
2.12.1 TUMORWACHSTUMS VERZOEGERUNG 47
2.12.2 BESTIMMUNG DER TOXIZITAET 49
2.13 FLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN EX VIVO 49
2.14 STATISTISCHE AUSWERTUNG 49
ERGEBNISSE 50
3.1 ANALYTIK DER HSA-KONJUGATE 50
3.1.1 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAMME 50
3.1.2 UV-SPEKTREN 51
3.1.3 GEL-DRUCK-CHROMATOGRAMME 54
3.1.4 GEL DER ISOELEKTRISCHEN FOKUSSIERUNG 54
3.1.5 ELEKTROPHEROGRAMME 5 5
3.2 ERMITTLUNG DER WACHSTUMSBEDINGUNGEN DER VERWENDETEN ZELLINIEN 57
3.2.1 WACHSTUMSKURVEN 57
3.2.2 FLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN 61
3.2.3 EINFLUSS VON FCS, HSA UND SERUMERSATZSTOFFEN AUF DIE
ZEILPROLIFERATION 63
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS DI
3.2.4 BEEINFLUSSUNG DER ZEILUEBERLEBENSRATE 66
3.3 NACHWEIS DER POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-AKTIVIERUNG UND -INHIBITION
IN VITRO 69
3.3.1 POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-AKTIVIERUNG DURCH PHOTONENBESTRAHLUNG
69
3.3.2 POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-INHIBITION 70
3.4 TOXIZITAETSTESTS 73
3.4.1 PROLIFERATIONSTEST 73
3.4.2 KOLONIEBILDUNGSTEST 76
3.4.3 FLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG 82
3.5 BESTIMMUNG DER RADIOSENSIBILISIERUNG IN VITRO 85
3.5.1 BESTIMMUNG DER OPTIMALEN VERSUECHSBEDINGUNGEN 85
3.5.2 ZEILUEBERLEBENSKURVEN 88
3.5.3 FLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN IN VITRO 92
3.6 RADIOSENSIBILISIERUNG IN VIVO 97
3.6.1 NACHWEIS DER POLY(ADP-RIBOSE)-POLYMERASE-AKTIVIERUNG IN VIVO 97
3.6.2 PHARMAKOKINETIK HSA-GEBUNDENER PARP-INHIBITOREN 98 3.6.2.1
BLUT-UND PLASMA-CLEARANCE 98
3.6.2.2 ORGANBILANZIERUNG 99
3.6.2.3 SZINTIGRAPHIE 101
3.6.2.4 I9 F-NMR-BILDGEBUNG 105
3.6.3 BESTIMMUNG DER TUMORWACHSTUMSVERZOEGERUNG IN VIVO 108 3.6.3.1
3-AMINOBENZAMID UND EINMALBESTRAHLUNG 108
3.6.3.2 FRAKTIONIERTE BESTRAHLUNG 109
3.6.3.3 FREIES BZW. HSA-GEBUNDENES 3-AMINOBENZAMID SOWIE
4-AMINO-1,8-NAPHTHALIMID UND FRAKTIONIERTE BESTRAHLUNG 109 3.6.3.4
4-AMINO-1,8-NAPHTHALIMID MIT EINZEITBESTRAHLUNG VON DU 145 -TUMOREN AUF
NACKTMAEUSEN 110
3.6.4. TOXIZITAET IN VIVO 111
3.6.5 FLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN EX VIVO 112
4 DISKUSSION 116
4.1 SYNTHESE UND ANALYTIK DER HSA-KONJUGATE 117
4.1.1 EINFACHE SYNTHESE DER HSA-KONJUGATE 117
4.1.2 INDIREKTE GEHALTSBESTIMMUNG DER HSA-KONJUGATE 118
4.1.3 MOEGLICHKEIT DER RADIOAKTIVEN MARKIERUNG DER HSA-KONJUGATE 118 4.2
WIRKUNG DER FREIEN UND TRAEGERGEBUNDENEN PARP-INHIBITOREN 118 4.2.1
PARP-INHIBITOREN ALS RADIOSENSIBILISATOREN 119
4.2.2 ZELLKUTURSYSTEME FUER MAKROMOLEKUELE 120
4.2.3 EINFLUSS VON HSA AUF DIE ZELLPROLIFERATION 121
4.2.4 ENZYMAKTIVIERUNG UND -INHIBITION 122
4.2.5 TOXIZITAET DER FREIEN UND TRAEGERGEBUNDENEN PARP-INHIBITOREN 125
4.2.6 RADIOSENSIBILISIERUNG DER FREIEN UND TRAEGERGEBUNDENEN
PARP-INHIBITOREN IN VITRO 128
4.3 VERTEILUNG ANHAND VON SZINTIGRAMMEN UND NMR-AUFNAHMEN 132
IMAGE 5
VI ABBILDUNGSVERZEICHNIS
3.22 WACHSTUMSKURVE IN 1 % ULTROSER-MEDIUM MIT UNTERSCHIEDLICHEN HSA-
KONZENTRATIONEN 66
3.23 PLATING EFFICIENCIES VON VIER HUMANZELLINIEN IN MODIFIZIERTEM
MEDIUM 67 3.24 IMMUNZYTOCHEMISCHER NACHWEIS VON POLY(ADP-RIBOSE) NACH
Y-BESTRAHLUNG 69 3.25 IMMUNZYTOCHEMISCHER NACHWEIS VON POLY(ADP-RIBOSE)
NACH BESTRAHLUNG MIT 50 GY 70
3.26 INHIBITION DER POLY(ADP-RIBOSE)-BILDUNG IN BESTRAHLTEN UND MIT
STEIGENDEN ANI- KONZENTRATIONEN INKUBIERTE DU 145-ZELLEN 71
3.27 WACHSTUMSVERZOEGERUNG VON VERSCHIEDENEN KONZENTRATIONEN 3-ABA UND
ANI 74 3.28 WACHSTUMSVERZOEGERUNG VON VERSCHIEDENEN HSA-, 3-ABA2-HSA- UND
ANI-HSA-KONZENTRATIONEN 75
3.29 ZEILUEBERLEBENSRATE VERSCHIEDENER ZELLINIEN NACH UNTERSCHIEDLICHER
INKUBATIONS- DAUER MIT 3-ABA BZW. ANI 78
3.30 ZEILUEBERLEBENSRATE VERSCHIEDENER ZELLINIEN NACH UNTERSCHIEDLICHER
INKUBATIONS DAUER MIT HSA, 3-ABA 2 -HSA, ANI-HSA 80
3.31 WACHSTUMSBEDINGTE VERAENDERUNGEN DER ZELLZYKLUSVERTEILUNG VON ATI-
UND DU145-ZELLEN 83
3.32 UEBERLEBENSRATE VON V79-ZELLEN NACH INKUBATION MIT VERSCHIEDENEN
3-ABA- KONZENTRATIONEN FUER 18 H VOR ODER NACH BESTRAHLUNG 85
3.33 STRAHLENINDUZIERTE ZYTOTOXIZITAET NACH 8 GY ALS FUNKTION DER
UNTERSCHIEDLICHEN EXPOSITIONSZEIT VON 3-ABA, ANI, 3-ABA 2 -HSA UND
ANI-HSA IN V79-ZELLEN 86 3.34 KINETIK MIT 20 UM ANI MIT UND OHNE
BESTRAHLUNG MIT 9 GY IN DU 145-ZELLEN 87 3.35 ZEILUEBERLEBENSKURVEN
VERSCHIEDENER 3-ABA-KONZENTRATIONEN 88
3.36 ZELLUEBERLEBENSKURVEN VON 3-BZW. 4-SS-D-GLC-BA SOWIE DEREN EDUKTE 3-
BZW. 4-OH-BA 89
3.37 ZELLUEBERLEBENSKURVEN MIT VERSCHIEDENEN ANI-KONZENTRATIONEN 90 3.38
ZELLUEBERLEBENSKURVEN FUER VERSCHIEDENE KONZENTRATIONEN 3-ABA2-HSA UND
ANI-HSA 91
3.39 WACHSTUMSBEDINGTE VERAENDERUNGEN DER ZELLZYKLUSVERTEILUNG VON
ATI-ZELLEN NACH BESTRAHLUNG 92
3.40 G 2 M-PHASEN-UND APOPTOSE-ANTEILE IN AT1-ZELLEN NACH 2 GY 92
3.41 WACHSTUMSBEDINGTE VERAENDERUNGEN DER ZELLZYKLUSVERTEILUNG VON
DU145-ZELLEN NACH BESTRAHLUNG MIT 10 GY 93
3.42 G 2 M-PHASEN-UND APOPTOSE-ANTEILE IN DU 145-ZELLEN NACH 10 GY 93
3.43 WACHSTUMSBEDINGTE VERAENDERUNGEN DER ZELLZYKLUSVERTEILUNG VON
ATI-ZELLEN NACH 72 H: KONTROLLE, 3-ABA, 10 GY UND 3-ABA MIT 10 GY 94
3.44 WACHSTUMSBEDINGTE VERAENDERUNGEN DER ZELLZYKLUSVERTEILUNG VON
DU145-ZELLEN NACH 72 H: KONTROLLE, 3-ABA, 10 GY UND 3-ABA MIT 10 GY 94
3.45 ZELLZYKLUSVERTEILUNG DER AKUTEN APOPTOSE VON DU 145-ZELLEN 12 H
NACH BEHANDLUNG MIT ANI-HSA UND BESTRAHLUNG 95
3.46 WACHSTUMSBEDINGTE VERAENDERUNGEN DER ZELLZYKLUS VERTEILUNG VON DU
145-ZELLEN NACH 72 H: KONTROLLE, ANI-HSA, 10 GY UND ANI-HSA MIT 10 GY 95
3.47 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON PAR IN VERSCHIEDENEN
RATTENGEWEBEN NACH BESTRAHLUNG 97
IMAGE 6
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VH
3.48 BLUT- UND PLASMASPIEGEL IN PROZENT DER AUSGANGSAKTIVITAET VON
VERSCHIEDENEN IN IN-DTPA-HSA-KONJUGATEN 99
3.49 STANDARDISIERTE AUFNAHMERATE DER WICHTIGSTEN ORGANE BEI ENTNAHME
NACH 72 H 100 3.50 SZINTIGRAMME EINER REPRAESENTATIVEN COPENHAGEN-RATTE
MIT ATI-TUMOR AM RECHTEN HINTERBEIN NACH APPLIKATION VON
IN-DTPA-ANI-HSA 102
3.51 SZINTIGRAMME NACH 48 H VON APPLIKATION VON IN-DTPA-HSA UND 1
LN-DTPA-3-ABAN-HSA (N = 2, 5, 10) 103
3.52 SZINTIGRAPHISCHE TUMOR- UND LEBERKINETIK DER
IN-DTPA-HSA-KONJUGATE 104 3.53 SZINTIGRAPHISCHE ORGANVERTEILUNG UEBER 72
H NACH APPLIKATION VON 111 IN-DTPA-ANI-HSA 104
3.54 19 F-NMR-BILDGEBUNG EINER REPRAESENTATIVEN COPENHAGEN-RATTE MIT
ATI-TUMOR NACH VERSCHIEDENEN ZEITPUNKTEN NACH APPLIKATION VON 3-ABA-TFE
106 3.55 - 19 F-NMR-BILDGEBUNG EINER REPRAESENTATIVEN COPENHAGEN-RATTE
MIT ATI-TUMOR NACH VERSCHIEDENEN ZEITPUNKTEN NACH APPLIKATION VON
(3-ABA-TFE)IO-HSA 107 3.56 TUMOR- UND LEBERKINETIK VON 3-ABA-TFE UND
(3-ABA-TFE)I O -HSA MIT
19 F-NMR-BILDGEBUNG UEBER 200 H 105
3.57 TUMORWACHSTUMSVERZOEGERUNG EINER EINZEITBESTRAHLUNG VON AT1
-TRAGENDEN COPENHAGEN-RATTEN (20 GY) UND APPLIKATION VON 3-ABA (2 MM)
108 3.58 KOERPERGEWICHTS VERLAUF VON COPENHAGEN-RATTEN MIT EINEM DUNNING
AT 1 - PROSTATAKARZINOM EINER UNBEHANDELTEN KONTROLLGRUPPE GEGENUEBER
EINMAL-
BESTRAHLUNG UND KOMBINATION VON BESTRAHLUNG MIT 3-ABA 111
3.59 KOERPERGEWICHTSVERLAUF VON FRAKTIONIERT BESTRAHLTEN
COPENHAGEN-RATTEN 112 3.60 VERTEILUNG DER ZELLPOPULATIONEN IN
ATI-TUMOREN NACH VERSCHIEDENEN ZEITPUNKTEN NACH BESTRAHLUNG MIT 20 GY
113
3.61 VERTEILUNG DER ZELLPOPULATIONEN IN ATI-TUMOREN NACH VERSCHIEDENEN
ZEITPUNKTEN NACH BESTRAHLUNG MIT 10X3 GY 113
3.62 VERTEILUNG DER ZELLPOPULATIONEN IN O342-TUMOREN NACH VERSCHIEDENEN
ZEITPUNKTEN NACH BESTRAHLUNG MIT 20 GY 114
3.63 G2M-PHASEN- UND APOPTOSEANTEIL IN 0342-TUMOREN NACH BEHANDLUNG MIT
* ANI-HSA UND EINMALBESTRAHLUNG 114
4.1 STRUKTURELLE ANFORDERUNGEN AN PARP-INHIBITOREN VOM BENZAMIDTYP 124
4.2 GRAPHISCHE ERMITTLUNG DER PLASMAHALBWERTSZEIT VON HSA UND
3-ABAIO-HSA 134
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