DNA-abhängige RNA-Polymerase I von Drosophila hydei: immunologische und molekulargenetische Charakterisierung
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1997
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INHALT
INHALT
.
I
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
VORAUSSETZUNGEN
FUER
DIE
ARBEIT
.
6
2.
ERGEBNISSE
.
9
2.1
C
HARAKTERISIERUNG
DES
P
OLYMERASE
I-K
OMPLEXES
AUF
DER
P
RO
TEINEBENE
.
9
2.1.1
S
PEZIESSPEZIFITAET
DES
I
MMUNSERUMS
GEGEN
P
OL
1
.
9
2.1.2
R
EAKTIONEN
DES
ANTI
-P
OL
I-S
ERUMS
IN
I
MMUNOBLOT
-E
XPERIMENTEN
.
13
2.1.3
I
DENTIFIZIERUNG
DER
DER
P
OL
I
ZUGEHOERIGEN
P
ROTEINE
IM
W
ESTERN
-B
LOT
.
14
2.1.4
I
DENTIFIZIERUNG
DER
GROEBTEN
P
OL
I-U
NTEREINHEIT
UND
IHRER
S
PALTPRODUKTE
IN
D.
HTDEA
G
ESAMTPROTEINPRAEPARATION
.
16
2.1.5
U
NTERSUCHUNG
DER
UNSPEZIFISCHEN
ENZYMATISCHEN
A
KTIVITAET
DER
P
OL
1
.
18
POL
I-AKTIVITAET
IN
DER
ANWESENHEIT
MONOSPEZIFISCHER
ANTI-POL
I
ANTIKOERPERN
AUS
KANINCHEN
.
20
EINFLUSS
HUMANER
ANTI-POL
I
-
ANTIKOERPER
AUF
NICHT-SPEZIFISCHE
ENZYMAKTIVITAET
.
20
2.1.6
I
SOLIERUNG
DES
P
OLYMERASE
I-K
OMPLEXES
AUS
KUN-DH-33-Z
ELLEN
MITTELS
I
MMUNPRAEZIPITATION
.
24
2.2
M
OLEKULARGENETISCHE
A
NALYSE
DES
D
H
RPI186
.
26
2.2.1
U
MKLONIERUNG
UND
E
RSTELLUNG
EINER
R
ESTRIKTIONSKARTE
DER
CDNA
K
LONE
FUER
DIE
ERSTE
U
NTEREINHEIT
DER
RNA-P
OLYMERASE
I.
26
2.2.2
S
EQUENZANALYSE
DER
C
DNA-K
LONE
.
27
2.2.3
A
NALYSE
DER
ABGELEITETEN
A
MINOSAEURESEQUENZ
VON
D
H
RPI186
.
29
2.2.4
N
OTHERN
-
H
YBRIDISIERUNG
.
30
2.2.5
PRIMER
EXTENSION
-ANALYSE
DES
DHRPI
1
86-TRANSKRIPTES
.
31
2.2.6
L
OKALISIERUNG
DES
D
H
RPI186-L
OCUS
AUF
POLYTAENEN
C
HROMOSOMEN
VON
D.
HYDEI
.
32
2.2.8
A
NALYSE
DES
K
LONS
D2-2
.
33
ANHANG
.
35
1.
C
DNA-S
EQUENZ
VON
D
H
RPI186
.
35
2.
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZ
FUER
DIE
GROESSTE
UNTEREINHEIT
DER
RNA
POLYMERASE
I
VON
D.HYDEI
.
37
3.
DISKUSSION
.
43
3.1
D
AS
I
MMUNSERUM
GEGEN
RNA-P
OLYMERASE
I
AUS
D.
HYDEI
ZEIGT
EINE
UNGEWOEHNLICHE
SPEZIESSPEZIFITAET
.
43
3.2
D
IE
GROBEN
U
NTEREINHEITEN
DER
RNA-P
OLYMERASE
I
KOENNEN
IM
W
ESTERN
-
BLOT
IDENTIFIZIERT
UND
ANALYSIERT
WERDEN
.
44
INHALT
3.3
D
ER
P
OLYMERASE
I-K
OMPLEX
LABT
SICH
DURCH
I
MMUNPRAEZIPITATION
AUS
G
ESAMTZELLLYSATEN
ISOLIEREN
.
46
3.4
U
NSPEZIFISCHE
E
NZYMAKTIVITAET
DER
RNA-P
OLYMERASE
I
WIRD
DURCH
HOCHSPEZIFISCHE
ANTIKOERPER
AUS
KANINCHEN
NICHT
BEEINFLUSST
.
46
HUMANE
ANTI-POLYMERASE
I-ANTIKOERPER
BEWIRKEN
HEMMUNG
DER
UNSPEZIFISCHEN
ENZYMAKTIVITAET
.
47
3.5
D
H
RPI
186
IST
EIN
TYPISCHES
G
EN
,
DAS
FUER
DIE
GROESSTE
UNTEREINHEIT
EINER
RNA-P
OLYMERASE
I
KODIERT
.
50
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
55
5.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
57
5.1
B
IOLOGISCHES
M
ATERIAL
.
;
.
57
FLIEGEN
.
57
BAKTERIENSTAEMME
.
57
VEKTOREN
.
58
5.3
N
UKLEINSAEURECHEMISCHE
M
ETHODEN
.
58
5.3.
1
I
SOLIERUNG
VON
N
UKLEINSAEUREN
.
58
PLASMID-DNA
.
58
PHAGEN-DNA
.
59
GESAMT-RNA
.
60
5.3.2
K
LONIERUNGSTECHNIKEN
.
60
RESTRIKTIONSANALYSE
VON
DNA
.
61
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
61
5
'
-DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-DNA
.
61
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
61
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
VON
E.COLI-ZELLEN
(INOUE
ET
AL.
1990)
.
62
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
63
UNIDIREKTIONALE
VERKUERZUNG
MIT
EXONUCLEASE
III
.
63
SEQUENZIERUNG
(SANGER
ET
AL.,
1977)
.
64
5.2.3
M
ARKIERUNG
VON
DNA-F
RAGMENTEN
.
64
IN
VITRO
-
TRANSKRIPTION
.
64
OLIGO-MARKIERUNG
VON
DNA
.
65
5
'
-ENDMARKIERUNG
.
66
PRIMER
EXTENTION
(DAVIES
ET
AL.,
1986)
.
66
SOUTHERN-TRANSFER
(SOUTHERN,
1975)
.
68
PLAQUE-LIFT-TRANSFER
(BENTON
UND
DAVIS,
1977)
.
68
HYBRIDISIERUNG
AUF
DNA-FILTER
.
68
NOTHERN-TRANSFER
.
69
HYBRIDISIERUNG
AUFNOTHERN-FILTER
.
69
IN
SITU
-
HYBRIDISIERUNG
AUF
POLYTAENE
CHROMOSOMEN
.
70
NACHWEIS
VON
SIGNALEN
NACH
DER
HYBRIDISIERUNG
.
71
5.4
P
ROTEINCHEMISCHE
M
ETHODEN
.
71
N
INHALT
5.4.1
I
SOLIERUNG
VON
P
ROTEINEN
AUS
G
EWEBE
BZW
.
Z
ELLKULTUREN
.
71
5.4.2
I
SOLIERUNG
VON
Z
ELLKERNEN
AUS
K
ULTURZELLEN
.
72
5.4.3
SDS-PAGE
.
73
5.4.4
W
ESTERN
-B
LOT
.
75
5.3.5
I
MMUNOBLOT
.
75
5.4.6
I
MMUNPRAEZIPITATON
.
76
5.4.7
A
FFINITAETSREINIGUNG
VON
A
NTIKOERPERN
.
77
5.3.8
AEVS
/
TU
Z
YTOIMMUNOFLUORESCENZ
.
77
5.3.9
N
ICHT
-
SPEZIFISCHER
T
RANSKRIPTIONSTEST
FUER
RNA
P
OLYMERASE
1
.
78
2.4.10
E
XPRESSION
VON
F
REMDGENEN
IN
E.
COLI
.
79
2.5
S
ONSTIGE
M
ETHODEN
.
79
2.5.1
Z
ELLINIEN
.
79
HELA-ZELLEN
.
80
NSO.
.
80
KUN-DH-33
.
80
S
2
.
80
KCO.
.
81
MEDIEN
FOER
DIE
ZELLKULTUR
.
81
2.4.2
G
EWINNUNG
VON
D
AEOSOTWZ
^-E
MBRYONEN
.
84
A
BKUERZUNGEN
.
85
6.
LITERATUR
.
86
7.
ANMERKUNGEN
.
95
8.
ERKLAERUNG
.
96
9.
LEBENSLAUF
.
97
III |
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