Tumor-spezifische Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten mit Hilfe chimärer Rezeptoren:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
|
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
ADAPTIVE
IMMUNABWEHR
.
1
1.2
TUMOR-ASSOZIIERTE
ANTIGENE
.
2
1.3
IMMUNTHERAPIE
VON
MALIGNEN
TUMOREN
.
3
1.3.1
ANTIKOERPER-GESTUETZTE
IMMUNTHERAPIEN
.
3
1.3.2
ADOPTIVE
ZELLULAERE
IMMUNTHERAPIE
.
4
1.3.3
KOMBINATION
VON
ANTIKOERPER-VERMITTELTER
UND
ZELLULAERER
IMMUNTHERAPIE
.
5
1.4
CHIMAERE
T-ZELL-REZEPTOREN
.
6
1.4.1
PHYSIOLOGISCHE
STRUKTUR
DES
T-ZELL-REZEPTORKOMPLEXES
.
7
1.4.2
CHIMAERE
T-ZELL-REZEPTOREN
DER
ERSTEN
GENERATION:
DER
IG/TCR-TYP
.
8
1.4.3
CHIMAERE
REZEPTOREN
DER
ZWEITEN
GENERATION:
DER
SCFV-R-TYP
.
9
1.5
TUMOR-TARGETING
ZYTOTOXISCHER
T-LYMPHOZYTEN
MITTELS
CHIMAERER
T-ZELL-REZEPTOREN
.
12
1.6
GASTROINTESTINALE
TUMOREN
.
14
1.7
MORBUS
HODGKIN
.
15
1.8
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
16
2
MATERIAL
.
17
2.1
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
.
17
2.2 LOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
DIE GELELEKTROPHORESE
.
18
2.3
GROESSENMARKER
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
18
2.3.1
DNS-GROESSENMARKER
.
18
2.3.2
PROTEIN-MOLEKULARGEWICHTSMARKER
.
19
2.4
BAKTERIENSTAEMME
.
19
2.5
BAKTERIOPHAGEN
.
19
2.6
MEDIEN
FUER
DIE
BAKTERIENKULTUR
UND
MEDIENZUSAETZE
.
19
2.7
ZELLINIEN
.
20
2.8
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
UND
MEDIENZUSAETZE
.
21
2.9
ANTIBIOTIKA
.
22
2.10
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
.
22
2.10.1
PRIMAERANTIKOERPER
.
22
2.10.2
KONJUGIERTE
SEKUNDAERANTIKOERPER
.
22
2.10.3
POLYKLONALE
ANTIKOERPER
.
23
2.11
ANTIGENE
.
23
2.12
MUEZINE
.
23
2.13
KIT-SYSTEME
.
24
2.14
OLIGONUKLEOTIDE
.
24
2.15
VEKTOREN
.
25
3
METHODEN
.
27
3.1
GRUNDLEGENDE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
27
3.2
NUKLEINSAEURE-PRAEPARATIONEN
.
27
3.2.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
.
27
3.2.1.1
MIDI-DNS-PRAEPARATION
NACH
ALKALISCHER
LYSE
.
27
3.2.1.2
MAXI-PRAEPARATION
VON
ENDOTOXINFREIER
PLASMID-DNS
DURCH
BINDUNG
AN
EINE
ANIONENAUSTAUSCHER-SAEULE
.
28
3.2.1.3
SCHNELLPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
NACH
DER
KOCH-(BOILING)
METHODE
.
28
3.2.2
PRAEPARATION
VON
RNS
.
29
3.2.2.1
MIDI-PRAEPARATION
VON
POLYA
+
MRNS
AUS
KULTURZELLEN MITTELS
MATRIXGEBUNDENER
DTAO-OLIGONUKLEOTIDE
.
29
3.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
29
3.3.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
.
29
3.3.2
ETHIDIUMBROMID-TUEPFELTEST
.
30
3.4
GELELEKTROPHORESE
.
30
3.4.1
NATIVE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.
30
3.4.2
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
30
3.5
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE
.
31
3.5.1
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE
MITTELS
ZENTRIFUGATION
DURCH
SILIKONISIERTE
GLASWOLLE
.
31
3.5.2
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE
MITTELS
ELEKTROELUTION
.
32
3.5.3
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE
MITTELS
SAEULEN-ZENTRIFUGATION,
QIAQUICK
.
32
3.6
ENZYMKATALYSIERTE
MODIFIKATIONEN
VON
DNS
.
33
3.6.1
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-5
'
-ENDEN
.
33
3.6.2
AUFFUELLEN
EINZELSTRAENGIGER
5'-UEBERHAENGENDER
DNS-ENDEN
MIT
HILFE
DER
KLENOW-POLYMERASE.
33
3.6.3
LIGATION
VON
DNS-DOPPELSTRAENGEN
.
33
3.7
BAKTERIENKULTUR
.
34
3.7.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
34
3.7.1.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
DH5A
BAKTERIEN
.
34
3.7.1.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
TG1
BAKTERIEN
.
34
3.7.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
35
3.7.2.1
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.COLI
DH5A
BAKTERIEN
.
35
3.7.2.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.COLI
TG1
BAKTERIEN
.
35
3.8
PHAGEN-INFEKTION
VON
BAKTERIEN
.
35
3.8.1
M13
PHAGEN-RESCUE
.
35
3.8.2
PANNING
.
36
3.8.3
MIKROTITERPLATTEN-RESCUE
.
37
3.8.4
PEG-PRAEZIPITATION
VON
PHAGEN
.
37
3.9
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
37
3.10
DIREKTE
PLASMID-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDESOXY-METHODE
.
38
3.11
ZELLKULTUR
.
39
3.11.1
GRUNDLEGENDEN
METHODEN
DER
EUKARYONTISCHEN
ZELLKULTUR
.
39
3.11.2
TRANSFEKTIONSMETHODEN
.
39
3.11.2.1
CALCIUM-PHOSPHAT-TRANSFEKTION
.
39
3.11.2.2
DNS-TRANSFEKTION
MIT
HILFE
DES
TRANSFEKTIONSREAGENZ
DOT
AP
.
40
3.11.2.3
ELEKTROPORATION
.
41
3.11.3
INDUKTION
DER
IL-2-FREISETZUNG
.
41
3.11.3.1
STIMULATION
TRANSFIZIERTER
MD45-ZELLEN
MIT
ANTIGEN
.
41
3.11.3.2
STIMULATION
TRANSFIZIERTER
MD45-ZELLEN
DURCH
ANTIGENPOSITIVE
TUMORZELLEN
.
42
3.11.4
IN
VIRRO-ZYTOTOXIZITAETSTEST
.
42
3.12
SEROLOGISCHE
METHODEN
.
43
3.12.1
CAT-ELISA
.
43
3.12.2
PHAGEN-ELISA
.
44
3.12.3
IL-2-ELISA
.
45
3.12.4
ELISA
ZUM
NACHWEIS
CHIMAERER
REZEPTOREN
.
45
3.12.5
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
46
3.12.6
IMMUNPRAEZIPITATION
.
47
3.13
ANALYSEVERFAHREN
FUER
PROTEINE
.
47
3.13.1
COLORIMETRISCHE
PROTEINBESTIMMUNG
.
47
3.13.2
DISKONTINUIERLICHE
GELELEKTROPHORESE
.
48
3.13.3
WESTERN
BLOT-ANALYSE
.
48
4
ERGEBNISSE
.
49
4.1
KONSTRUKTION
DER
SINGLE
CHAIN
ANTIKOERPERFRAGMENTE
HRS3-SCFV
UND
B72.3-SCFV
.
49
4.2
NACHWEIS
DER
BINDUNGSSPEZIFITAET
DES
PHAGENANTIKOERPERS
HRS3-SCFV
.
51
4.2.1
ENZYMGEKOPPELTE
IMMUNADSORPTIONSTESTS
.
.
.
51
4.3
NACHWEIS
DER
BINDUNGSSPEZIFITAET
DES
PHAGENANTIKOERPERS
B72.3-SCFV
.
53
4.3.1
ENZYMGEKOPPELTE
IMMUNADSORPTIONSTESTS
.
53
4.3.2
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSEN
.
57
4.4
SEQUENZANALYSE
DER
SINGLE
CHAIN-ANTIKOERPER
HRS3-SCFV
UND
B72.3-SCFV
.
58
4.5 KONSTRUKTION
DER
REKOMBINANTEN
DNS
CHIMAERER
ANTI-CD30
UND
ANTI-TAG72
REZEPTOREN
.
58
4.6
TRANSFEKTION
DER
CTL-HYBRIDOMLINIE
MD45
MIT
DER
REKOMBINANTEN
REZEPTOR-DNS
UND
SELEKTION
STABILER
TRANSFEKTANDEN
.
61
4.7
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
CHIMAEREN
REZEPTORS
HRS3-SCFVRY.
65
4.7.1
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSEN
.
65
4.7.2
ENZYMGEKOPPELTE
IMMUNADSORPTIONSTESTS
.
67
4.7.3
WESTERN
BLOT-ANALYSE
.
69
4.8
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
CHIMAEREN
REZEPTORS
B72.3-SCFVRY.
70
4.8.1
ENZYMGEKOPPELTE
IMMUNADSORPTIONSTESTS.
70
4.8.2
WESTERN
BLOT-ANALYSE
.
72
4.9
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
DES
CHIMAEREN
REZEPTORS
HRS3-SCFVRY
.
73
4.9.1
AKTIVIERUNG
STABILER
HRS3-SCFVRY
KLONE
DURCH
DEN
OBERFLAECHEN
ADSORBIERTEN,
ANTI-IDIOTYPISCHEN
ANTIKOERPER
9G10
UND
CD30-POSITIVE
HODGKIN-LYMPHOMZELLEN
.
73
4.9.2
INHIBITION
DER
AKTIVIERUNG
DURCH
LOESLICHES
CD30-ANTIGEN
UND
LOESLICHEN
ANTI-IDIOTYPISCHEN
ANTIKOERPER
9G10
.
76
4.9.3
AKTIVIERUNG
DER
HRS3-SCFVRY
TRANSFEKTANDEN
DURCH
LOESLICHES
ANTIGEN
.
77
4.9.4
MHC-UNABHAENGIGE,
CD30-SPEZIFISCHE
ZYTOTOXIZITAET
DER
HRS3-SCFVRY
ZELLKLONE
.
79
4.10
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
DES
CHIMAEREN
REZEPTORS
B72.3-SCFVRY
.
81
4.10.1
AKTIVIERUNG
DER
B72.3-SCFVRY
ZELLKLONE
DURCH
OBERFLAECHENADSORBIERTES
BSM
UND
TAG72-POSITIVE
TUMORZELLEN
.
81
4.10.2
INHIBITION
DER
AKTIVIERUNG
DURCH
LOESLICHES
BSM
UND
DEN
LOESLICHEN,
MONOKLONALEN
ANTI-TAG72
ANTIKOERPER
B72.3
.
84
4.10.3
MHC-UNABHAENGIGE,
TAG72-SPEZIFISCHE
ZYTOTOXIZITAET
DER
B72.3-SCFVRY
KLONE
.
86
5
DISKUSSION
.
89
5.1
GASTROINTESTINALE
TUMORE
UND
MORBUS
HODGKIN
ALS
MODELLSYSTEME
ZUR
FUNKTIONELLEN
UNTERSUCHUNG
CHIMAERER
T-ZELL-REZEPTOREN
.
89
5.2
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
REKOMBINANTER
SCFV-ANTIKOERPERFRAGMENTE
MIT
SPEZIFITAET
FUER
TAG72
UND
CD30
.
91
5.3
KONSTRUKTION
UND
EXPRESSION
CHIMAERER
REZEPTOREN
MIT
SPEZIFITAET
FUER
DAS
TAG72-ANTIGEN
UND
DAS
CD30-ANTIGEN
.
91
5.4
DER
CHIMAERE
REZEPTOR
B72.3-SCFVRY
VERMITTELT
NACH
BINDUNG
EINES
KOHLENHYDRATEPITOPS
DES
TAG72-ANTIGENS
EINE
SPEZIFISCHE
T-ZELL-AKTIVIERUNG
.
94
5.5
DER
CHIMAERE
REZEPTOR
HRS3-SCFVRY
VERMITTELT
NACH
BINDUNG
VON
IMMOBILISIERTEM
CD30-ANTIGEN
EINE
EFFIZIENTE
T-ZELL-AKTIVIERUNG
.
95
5.6
THERAPEUTISCHE
BEDEUTUNG
DER
EXPERIMENTELLEN
ERGEBNISSE
.
97
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
101
7
ANHANG
.
103
7.1
NUKLEOTID
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
CHIMAEREN
REZEPTORS
B72.3-SCFVRY
.
103
7.2
NUKLEOTID
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
CHIMAEREN
REZEPTORS
HRS3-SCFVRY
.
105
8
LITERATURVERZEICHNIS
.
107
9
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
117 |
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