Bedeutung der G-Protein-vermittelten Transaktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors bei der mitogenen Signalübertragung:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
1998
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
REGULATION
DER
SIGNALTRANSDUKTION
DURCH
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
1
1.1.1.
REZEPTORTYROSINKINASEN
1
1.1.2.
ZYTOPLASMATISCHE
TYROSINKINASEN
4
1.1.3.
SUBSTRATE
VON
REZEPTORTYROSINKINASEN
5
1.2.
MAP-KINASEKASKADEN
UND
DIE
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
8
1.3.
G
PROTEIN-GEKOPPELTE
REZEPTOREN
10
1.4.
HETEROTRIMERE
G
PROTEINE
12
1.5.
REGULATION
ZELLULAERER
VORGAENGE
DURCH
G
PROTEIN
GEKOPPELTE
REZEPTOREN
13
1.5.1.
KONTROLLE
DER
INTRAZELLULAEREN
CAMP-KONZENTRATION
13
1.5.2.
AKTIVIERUNG
VON
PHOSPHOLIPASE
C
14
1.5.3.
REGULATION
VON
LONENKANAELEN
UND
-TRANSPORTEM
DURCH
G
PROTEIN-GEKOPPELTE
REZEPTOREN
15
1.5.4.
AKTIN-VERMITTELTE
REGULATION
DER
ZELLMORPHOLOGIE
DURCH
G
PROTEIN-GEKOPPELTE
REZEPTOREN
16
1.5.5.
ZELLWACHSTUM
UND-TRANSFORMATION
17
1.6.
ZIELSETZUNG
18
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
19
2.1.
BEZUGSQUELLENNACHWEIS
19
2.1.1.
CHEMIKALIEN
19
2.1.2.
ENZYME
20
2.1.3.
RADIOCHEMIKALIEN
20
2.1.4.
"KITS"
UND
SONSTIGES
20
2.1.5.
WACHSTUMSFAKTOREN
UND
LIGANDEN
21
2.2.
MEDIEN
UND
PUFFER
21
2.2.1.
MEDIUM
FUER
E.COLI
BAKTERIEN
21
2.2.2.
ZELLKULTURMEDIEN
22
2.2.3.
STAMMLOESUNGEN
UND
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
22
2.3.
BAKTERIENSTAEMME,
ZELLINIEN
UND
ANTIKOERPER
23
2.3.1.
BAKTERIENSTAEMME
23
2.3.2.
ZELLINIEN
24
2.3.3.
ANTIKOERPER
24
2.4.
PLASMIDE
UND OLIGONUKLEOTIDE
26
2.4.1.
AUSGANGSVEKTOREN
26
2.4.2.
IM
RAHMEN
DIESER
ARBEIT
VERWENDETE
VEKTOREN
27
2.4.3.
WICHTIGE
OLIGONUKLEOTIDE
28
2.5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
29
2.5.7.
PLASMIDPRAEPARATION
FUER
ANALYTISCHE
ZWECKE
29
2.5.2.
PLASMIDPRAEPARATION
FUER
PRAEPARATIVE
ZWECKE
29
2.5.3.
ENZYMATISCHE BEHANDLUNG
VON
DNA
29
2.5.3.1.
VERDAU
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
29
2.5.3.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5
'
-ENDEN
29
2.5.3.3.
VERKNUEPFUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
29
2.5.4.
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
29
2.5.5.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
30
2.5.6.
DNA-TRANSFER
IN
E.COLI
BAKTERIEN
30
2.5.6.I.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
BAKTERIEN
30
2.5.6.2.
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
E.COLI
BAKTERIEN
30
2.5.7.
DAUERKULTUREN
VON
E.COLI
BAKTERIEN
30
2.5.8.
SEQUENZIERUNG
30
2.6.
ARBEITEN
MIT
RNA
30
2.6.1.
PRAEPARATION
VON
RNA
30
2.6.2.
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
RNA
31
2.6.3.
NORTHERN
ANALYSE
31
2.6.3.1.
TRANSFER
VON
RNA
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
31
2.6.3.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
[A
32
P]-DATP
32
2.6.3.3.
HYBRIDISIERUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROBEN
MIT
RNA
32
2.7.
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
PCR
32
2.7.1.
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
UND
CDNA-FRAGMENTEN
32
2.7.2.
AUFREINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
33
2.7.3.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
33
2.8.
METHODEN
ZUR
ARBEIT
MIT
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
33
2.8.1.
ALLGEMEINE
ZELLKULTURTECHNIKEN
33
2.8.2.
MYKOPLASMENTEST
33
2.8.3.
LIPOFECTAMINE-TRANSFEKTION
VON
COS-7
ZELLEN
34
2.8.4.
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFTZIENZ
34
2.8.5.
RETROVIRALER
GENTRANSFER
IN
RAT-1
FIBROBLASTEN
34
2.8.6.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
ZELLEN
34
2.8.7.
MESSUNG
DER
INOSITOLPHOSPHATAKKUMULATION
35
2.8.8.
MESSUNG
DER
DNA-SYNTHESE
(
[METHYL
]THYMIDIN-EINBAU
)
35
2.9.
PROTEINANALYTISCHE
METHODEN
36
2.9.7.
STIMULATION
UND
TRITON
XLOO-LYSE
VON
ZELLEN
36
2.9.2.
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
EINES
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
36
(
GST)-FUSIONSPROTEINS
2.9.2.1.
EXPRESSION
EINES
GST-FUSIONSPROTEINS
IN
BAKTERIEN
36
2.9.2.2.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
GLUTATHION-SEPHAROSE
37
2.9.3.
PROTEINBESTIMMUNG
37
2.9.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
37
2.9.5.
IN
VITRO-ASSOZIATION
MIT
GST-FUSIONSPROTEIN
38
2.9.6.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
38
2.9.7.
FAERBUNG
UND
FIXIERUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
38
2.9.8.
?
RANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
38
2.9.9.
IMMUNDETEKTION
(IMMUNOBLOTANALYSE)
39
2.9.10.
BESTIMMUNG
DER
KATALYTISCHEN
AKTIVITAET
DER
MAP-KINASE
39
2.9.10.1.
MAP-KINASEREAKTION
IM
GEL
39
2.9.10.2.
IN
VITRO-KINASEREAKTION
MIT
IMMUNPRAEZIPITIERTER
MAP-KINASE
40
2.9.11.
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
PHOSPHATIDYLINOSITOL-3-KINASE
(PI3-KINASE
ASSAY)
40
2.9.12.
PHOSPHOAMINOSAEUREANALYSE
40
2.9.13.
PHOSPHOPEPTIDANALYSE
41
3.
ERGEBNISSE
42
3.1.
SPEZIFISCHE
ASSOZIATION
TYROSINPHOSPHORYLIERTER
GLYKO
PROTEINE
MIT
SHC
UND
GRB2
NACH
ENDOTHELINSTIMULATION
VON
RAT-1
FIBROBLASTEN
42
3.2.
TRANSAKTIVIERUNG
VON
REZEPTORTYROSINKINASEN
NACH
STIMULATION
ENDOGENER
G
PROTEIN-GEKOPPELTER
REZEPTOREN
44
3.2.1.
TRANSAKTIVIERUNG
DES
EGFRS
UND
VON
PL85
NEU
IN
RAT-1
FIBROBLASTEN
44
3.2.2.
ENDOTHELIN
STIMULIERT
TRANSIENTE
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
DES
EGFR
48
3.2.3.
EGFR-TRANSAKTIVIERUNG
IN
HACAT
KERATINOCYTEN,
ASTROZYTEN
UND
COS-7
ZELLEN
48
3.2.4.
TRANSAKTIVIERUNG
VON
HER4
IN
OVCAR-3
ZELLEN
51
3.3.
REKONSTITUTION
DER
GPCR-VERMITTELTEN
EGFR-TRANS
AKTIVIERUNG
IN
COS-7
ZELLEN
52
3.3.1.
TRANSIENTE
EXPRESSION
GQ-GEKOPPELTER
REZEPTOREN
IN
COS-7
ZELLEN
53
3.3.2.
TRANSIENTE
EXPRESSION
EINES
GI-GEKOPPELTEN
REZEPTORS
IN
COS-7
ZELLEN
53
3.4.
SPEZIFISCHE
INHIBITION
DER
GPCR-VERMITTELTEN
TYROSIN
PHOSPHORYLIERUNG
DES
EGFR
55
3.4.1.
STABILE
UND
TRANSIENTE
EXPRESSION
DER
DOMINANT-NEGATIVEN
EGFR-MUTANTE
HER-CD533
55
3.4.2.
INAKTIVIERUNG
DES
EGFRS
DURCH
DEN
SELEKTIVEN
EGFR
INHIBITOR
AG1478
57
3.4.3.
EGFR-UNABHAENGIGE
FAK
UND
PAXILLINTYROSINPHOSPHORYLIERUNG
59
3.5.
EGFR-VERMITTELTE
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
NACH
STIMULATION
G
PROTEIN-GEKOPPELTER
REZEPTOREN
60
3.5.1.
ASSOZIATION
TYROSINPHOSPHORYLIERTER
PROTEINE
MIT
GRB2
FUSIONSPROTEIN
60
3.5.2.
SHC-TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
UND
SHC-GRB2-INTERAKTION
64
3.5.3.
IDENTIFIKATION
VON
GABI
ALS
GRB2-INTERAGIERENDES,
TYROSIN
PHOSPHORYLIERTES
PROTEIN
66
3.5.4.
LPA-INDUZIERTE
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
SHP-2
68
3.6.
FUNKTION
DES
EGFRS
BEI
DER
GPCR-VERMITTELTEN
AKTIVIERUNG
DER
MAP-KINASEN
70
3.6.1.
INHIBITION
DES
EGFRS
INTERFERIERT
MIT
ENDOTHELIN-,
LPA
UND
THROMBIN-VERMITTELTER
MAP-KINASEAKTIVIERUNG
IN
RAT-1
FIBROBLASTEN
70
3.6.2.
INAKTIVIERUNG
DES
EGFRS
INHIBIERT
DIE
DURCH
GQ
UND
GI
GEKOPPELTE
REZEPTOREN
STIMULIERTE
MAP-KINASEAKTIVIERUNG
IN
COS-7
ZELLEN
73
3.6.3.
ZELLINIEN-SPEZIFISCHE
UNTERSCHIEDE
BEI
DER
GPCR
VERMITTELTEN
MAP-KINASEAKTIVIERUNG
77
3.7.
FUNKTION
DES
EGFRS
BEI
DER
GPCR-INDUZIERTEN
GENEXPRESSION
UND
ZELLPROLIFERATION
78
3.7.1.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DER
C-FOS-UND
C-JUN-GENE
IN
RAT-1
FIBROBLASTEN
79
3.7.2.
ANALYSE
DER
DNA-NEUSYNTHESE
IN
RAT-1
FIBROBLASTEN
81
3.8.
VERGLEICH
DER
GPCR-VERMITTELTEN
UND
STRESSINDUZIERTEN
EGFR-TRANSAKTI
VIERUNG
82
3.9.
FUNKTIONEN
VERSCHIEDENER
SIGNALMEDIATOREN
BEI
DER
GPCR-VERMITTELTEN
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
UND
MAP-
KINASEAKTIVIERUNG
83
3.9.1.
ROLLE
DER
PERTUSSIS
TOXIN-SENSITIVEN
UND
-INSENSITIVEN
G
PROTEINE
83
3.9.2.
STIMULATION
DER
EGFR-TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
DURCH
UEBEREXPRESSION
VON
GSSY
86
3.9.3.
REKONSTITUTION
DER
PTX-INSENSITIVEN
EGFR-TRANSAKTIVIERUNG
UND
MAP-KINASEAKTIVIERUNG
DURCH
EXPRESSION
VON
GOTQ/
Z
88
3.9.4.
UNTERSCHIEDE
BEI
DER
PTX-INSENSITIVEN
TRANSAKTIVIERUNG
DES
EGFRS
92
3.9.5.
EFFEKTE
DES
PKC-LNHIBITORS
GF109203X
93
3.9.6.
ROLLE
DES
EXTRAZELLULAEREN
KALZIUMS
IN
PC12 ZELLEN
95
3.9.7.
INHIBITORISCHE
EFFEKTE
DURCH
N-ACETYLCYSTEIN
96
3.9.8.
FUNKTION
DER
PI3-KINASE
98
3.9.9.
EFFEKTE
DES
SRC-TYROSINKINASEINHIBITORS
PPI
101
3.10.
VERGLEICH
DER
EGF
UND
LPA-INDUZIERTEN
SERIN/THREONINPHOSPHORYLIERUNG
DES
EGFRS
104
3.10.1.
GESAMTPHOSPHORYLIERUNG
UND
PHOSPHOAMINOSAEUREANALYSE
DES
EGFRS
105
3.10.2.
PHOSPHOPEPTIDANALYSE
DES
EGFRS
107
4.
DISKUSSION
110
4.1.
DIE
GPCR-VERMITTELTE
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
SHC
ALS AUSGANGSPUNKT
110
4.2.
DIE
TRANSAKTIVIERUNG VON
REZEPTORTYROSINKINASEN
UI
4.3.
ROLLE
DES
EGFRS
BEI
DER
GPCR-VERMITTELTEN
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
115
4.4.
ROLLE
DES
EGFRS
BEI
DER
MAP-KINASEAKTIVIERUNG
NACH
SIMULATION
G
PROTEIN-GEKOPPELTER
REZEPTOREN
119
4.5.
FUNKTIONEN
VON
PI-3-KINASEN
UND
SRC-KINASEN
BEI
DER
GPCR-VERMITTELTEN
SIGNALTRANSDUKTION.
121
4.6.
AUSBLICK
124
5.
ZUSAMMENFASSUNG
126
6.
LITERATURVERZEICHNIS
128
7.
ABKUERZUNGEN
147 |
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