Untersuchung molkereispezifischer Mikroorganismen mit molekularbiologischen Methoden:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 129 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
E
E
E
P
A.
EINLEITUNG
1
MATERIAL
UND
METHODEN
7
MIKROORGANISMEN
7
NAEHRMEDIEN
9
KLASSISCHE
VERFAHREN
ZUR
UNTERSUC
HUNG
VON
MIKROORGANISMEN
12
3.1
ANZUCHT
12
3.2
VERDONNUNGSREIHEN
UND
ANIMPFEN
VON
MILCH
13
3.3
KEIMZAHLBESTIMMUNG
14
3.3.1
BESTIMMUNG
DER
GESAMTKEIMZAHL
14
3.3.2
BESTIMMUNG
DER
LEBENDKEIMZAHL
14
3.4
BESTIMMUNG
VON
ZELL
UND
SPORENMORPHOLOGIE
14
3.5
STAMMHALTUNG
14
B4
NUKLEINSAEURE-ISOLIERUNG
15
4.1
DNA-ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIENZELLEN
NACH
MARMUR
(1961;
MODIFIZIERT)
15
4.2
DNA-ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIENZELLEN
MIT
DEM
QIAAMP
TISSUE
KIT
16
4.3
SCHNELLISOLATION
VON
DNA
AUS
MILCH
(EHRMANN
ET
AL.,
1994;
MODIFIZIERT)
17
4.4
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
UND
REINHEITSKONTROLLE
VON
18
NUKLEINSAEUREN
B3
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR:
SAIKI
ET
AL:
19
19881
5.1
REAKTIONSPRINZIP
19
5.2
DURCHFUEHRUNG
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
20
5.2.1
AMPLIFIKATION
VON
ISOLIERTER
DNA
UND
DNA
AUS
INTAKTEN
ZELLEN
20
5.2.2
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
21
5.2.2.I
5
'
-ENDLABELING
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DIG-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDPRIMEM
21
5.2.2.2
EINBAU
VON
HAPTENEN
IN
DNA-FRAGMENTE
MITTELS
PCR
21
5.3
KONTROLLE
VON
AMPLIFIKATION
UND
MARKIERUNG
22
BIFI
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
22
BJ
HERSTELLUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
23
7.1
KONSTRUKTION
UND
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
23
7.2
BESTIMMUNG
VON
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
DER
OLIGONUKLEOTIDE
23
73
ENZYMATISCHE
3
'
-ENDMODIFIKATION
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
23
7.3.1
VERLAENGERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
23
7.3.2
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIGOXIGENIN
ODER
FLUORESCEIN
24
7.4
CHEMISCHE
5
'
-ENDMODIFLKATION
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
24
7.4.1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
24
7.4.2
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIGOXIGENIN
24
7.5
KONTROLLE
DER
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
25
B8
GELELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
25
8.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
25
8.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
REINHEITSKONTROLLE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
26
H2
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
28
9.1
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
AUF
NYLON-MEMBRANEN
28
9.1.1
IMMOBILISIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
AUF
NYLON-MEMBRANEN
28
9.1.2
DURCHFUEHRUNG
DER
REVERSEN
HYBRIDISIERUNG
AUF
NYLON-MEMBRANEN
28
9.1.3
DETEKTION
DER
HYBRIDE
AUF
NYLON-MEMBRANEN
29
9.2
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
IN
MIKROTITERPLATTEN
(MTP)
30
9.2.1
IMMOBILISIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
IN
MIKROTITERPLATTEN
30
9.2.1.1
TYPEN
VON
MIKROTITERPLATTEN
30
9.2.1.2
IMMOBILISIERUNGSREAKTION
IN
COVALINKNH-MIKROTITERPLATTEN
30
9.2.1.3
IMMOBILISIERUNGSREAKTION
IN
MAXISORP-MIKROTITERPLATTEN
31
9.2.1.4
ERMITTLUNG
DES
BINDUNGSTYPS
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
AUF
POLYSTYROLOBERFLAECHEN
32
9.2.2
REVERSE
HYBRIDISIERUNGSREAKTION
IN
MIKROTITERPLATTEN
34
9.2.2.1
REVERSE
HYBRIDISIERUNGSVERFAHREN
34
9.2.2.2
UEBERPRUEFUNG
VERSCHIEDENER
HYBRIDISIERUNGSPARAMETER
34
9.2.2.3
DURCHFUEHRUNG
DER
REVERSEN
HYBRIDISIERUNG
IN
MIKROTITERPLATTEN
34
9.2.3
DETEKTION
DER
NUKLEINSAEURE-HYBRIDE
IN
MIKROTITERPLATTEN
36
9.2.3.1
DURCHFUEHRUNG
DER
DETEKTION
36
9.2.3.2
TEST
DER
ANTIKOERPER-ENZYM-KONJUGATE
37
9.2.4
LAGERUNG
VON
MIKROTITERPLATTEN
MIT
IMMOBILISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
38
9.3
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
AUF
YYDIP
STICKS
"
38
BJU
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
39
10.1
IMMOBILISIERUNG
DER
FANGSONDE
39
10.2
DURCHFUEHRUNG
DER
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
39
10.2.1
GLEICHZEITIGE
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA-AMPLIFIKAT
UND
SPEZIFISCHER
39
OLIGONUKLEOTIDSONDE
10.2.2
GEICHZEITIGE
HYBRIDISIERUNG
VON
ZWEI
SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
40
10.3
SEQUENTIELLE
DETEKTION
DER
NUKLEINSAEURE-HYBRIDE
40
.
ERGEBNISSE
42
J.
KONSTRUKTION
VON
OLIGOUUKKOTIDSONDEN
42
1.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
UNSPEZIFISCHEN
UNIVERSALSONDEN
42
1.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
42
1.2.1
EINSTELLUNG
DER
STRINGENZ
DURCH
VARIATION
VON
SALZGEHALT
UND
TEMPERATUR
43
1.2.2
EINSTELLUNG
DER
STRINGENZ
DURCH
VARIATION
VON
SALZ
UND
FORMAMIDGEHALT
44
1.2.3
EINSTELLUNG
DER
STRINGENZ
MITTELS
TETRAMETHYLAMMONIUMCHLORID
44
1.2.3.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
TETRAMETHYLAMMONIUMCHLORID
IN
DER
WASCHLOESUNG
44
1.2.3.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
TETRAMETHYLAMMONIUMCHLORID
IN
HYBRIDISIERUNGS
UND
46
WASCHLOESUNG
2
MODIFIKATION
UND
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
50
2.1
ENZYMATISCHE
3
'
-ENDMODIFIKATION
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
50
2.1.1
VERLAENGERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
50
2.1.2
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIGOXIGENIN
ODER
FLUORESCEIN
50
2.2
CHEMISCHE
S
'
-ENDMARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
51
23
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
RDNA-FRAGMENTEN
52
2.3.1
AMPLIFIKATIONSPRIMER
52
2.3.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
53
2.3.3
MARKIERUNG
DER
RDNA-FRAGMENTE
55
CJ
REVERSE
HYBRIDISIERUNG:
VERGLEICH
VON
NYLONMEMBRAN
UND
MIKROTITERPLATTE
55
3.1
IMMOBILISIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
AUF
MEMBRAN
UND
MIKROTITERPLATTE
55
3.2
REVERSE
HYBRIDISIERUNGSREAKTION
AUF
MEMBRAN
UND
MIKROTITERPLATTE
56
33
SENSITIVITAET
DER
REVERSEN
HYBRIDISIERUNG
AUF
MEMBRAN
UND
MIKROTITERPLATTE
56
C3
OPTIMIERUN
G
UND
STANDARDISIERUNG
DER
REVERSEN
HYBRIDISIER
UNG
IN
DER
MIKROTITERPLATTE
58
4.1
VERGLEICH
VON
MIKROTITERPLATTEN
MIT
KOVALENTEN
UND
ADSORPTIVEN
58
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
4.1.1
IMMOBILISIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
58
4.1.2
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
59
4.1.3
DETEKTION
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN-AMPLIFIKAT-HYBRIDEN
65
4.1.4
REHYBRIDISIERUNG
69
4.2
LAGERUNG
IMMOBILISIERTER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
69
4.3
ART
DER
OLIGONUKLEOTID-MATRIX-BINDUNG
70
5
REVERSE
HY
BRIDISIERUNG:
VERGLEICH
VON
-DIP
STICKS
"
UND
MI
KROTITERPLATTE
72
5.1
IMMOBILISIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
72
5.2
HYBRIDISIERUNG
72
5.3
DETEKTION
DER
HYBRIDE
72
6
SANDWICH-HVBRIDISIERUNG:
VERGLEICH
VON
-DIP
STICKS
"
UND
MIKROTITERPLATTE
73
6.1
IMMOBILISIERUNG
DER
FANGSONDE
74
6.2
HYBRIDISIERUNG
74
6.2.1
GLEICHZEITIGE
HYBRIDISIERUNG
VON
AMPLIFIKAT
UND
SPEZIFISCHER
SONDE
74
6.2.2
GLEICHZEITIGE
HYBRIDISIERUNG
VON
UNTERSCHIEDLICH
MARKIERTEN
SONDEN
74
6.3
DETEKTION
DER
HYBRIDE
74
CJ.
SPEZIESSPEZIFISCHE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
76
7.1
KONSTRUKTION
SPEZIFISCHER
PRIMER
76
7.2
BEDINGUNGEN
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
77
77
7.3
SPEZIFITAET
DER
SPEZIESSPEZIFISCHEN
POLYMERASE-KETTENREAKTION
SENSITIVITAETSBESTIMMUNG:
VERGLEICH
MOLEKULARBIOLOGISCHER
UND
MIKROBIOLOGISCHER
78
VERFAHREN
8.1
AUSWAHL
DER
MOLEKULARBIOLOGISCHEN
VERFAHREN
FUR
DIE
SENSITIVITAETSBESTIMMUNG
78
8.2
FESTLEGUNG
EINER
AUSSCHLUUEGRENZE
FUER
REVERSE
UND
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
78
8.3
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
MIT
ISOLIERTER
DNA
79
8.4
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
UNTER
EINSATZ
INTAKTER
ZELLEN
81
8.4.1
METHODIK
DER
SENSITIVITAETSBESTIMMUNG
81
8.4.2
SCHNELLISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
MILCH
81
8.4.3
SENSITIVITAET
MIT
INTAKTEN
ZELLEN
EINER
REINKULTUR
82
8.4.4
SENSITIVITAET
MIT
INTAKTEN
ZELLEN
AUS
MILCH
83
8.4.5
VERGLEICH
MIT
MIKROBIOLOGISCHEN
KULTURVERFAHREN
84
8.5
VERGLEICH
VON
REVERSER
UND
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
85
8.6
VERGLEICH
VON
HYBRIDISIERUNG
UND
SPEZIESSPEZIFISCHER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
85
D.
DISKUSSION
86
DJ
KONSTRUKTION
SPEZIFISCHER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
UND
QLIGONUKLE
OTIDPRIMER
87
1.1
AUSWAHL
DER
SONDEN
UND
PRIMER
87
1.2
SPEZIFITAET
DER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
UND
OLIGONUKLEOTIDPRIMER
88
1.3
EFFEKTE
DER
GEZIELTEN
VERLAENGERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
92
1.4
EFFEKTE
DER
MODIFIKATION
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
93
DJ
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
93
2.1
GRUENDE
FUER
DIE
WAHL
DER
METHODE
93
2.2
GRUENDE
FUER
DIE
WAHL
DER
MIKROTITERPLATTE
ALS
MATRIX
94
2.3
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
IN
DER
MIKROTITERPLATTE
-
ENTWICKLUNG
EINES
SCHNELLTESTS
95
2.3.1
AMPLIFIKATION
UND
MARKIERUNG
VON
ZIELNUKLEINSAEUREN
95
2.3.2
IMMOBILISIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
96
2.3.2.1
VERGLEICH
DER
POLYSTYROLOBERFLAECHEN
96
2.3.2.2
KLAERUNG
DES
BINDUNGSMECHANISMUS
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
AN
POLYSTYROLOBERFLAECHEN
97
2.3.3
HYBRIDISIERUNG
98
2.3.3.1
AUSWAHL
UND
OPTIMIERUNG
DES
HYBRIDISIERUNGSVERFAHRENS
99
2.3.2.2
OPTIMIERUNG
VERSCHIEDENER
PARAMETER
DER
HYBRIDISIERUNG
100
2.3.4
DETEKTION
DER
HYBRIDE
101
2.3.5
KONTROLLMECHANISMEN
DER
REVERSEN
HYBRIDISIERUNG
102
2.3.6
REHYBRIDISIERUNG
103
2.3.7
LAGERBARKEIT
VON
MIKROTITERPLATTEN
MIT
IMMOBILISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
103
2.4
REVERSE
HYBRIDISIERUNG
AUF
YYDIP
STICKS
"
103
DJ
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
104
3.1
GLEICHZEITIGE
HYBRIDISIERUNG
VON
AMPLIFIKAT
UND
SPEZIFISCHER
SONDE
104
3.2
GLEICHZEITIGE
HYBRIDISIERUNG
MIT
UNTERSCHIEDLICH
MARKIERTEN
SONDEN
105
3.3
SEQUENTIELLE
DETEKTION
DER
HYBRIDE
105
3.4
VERGLEICH
DER
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
IN
MIKROTITERPLATTE
UND
YYDIP
STICKS
"
106
3.5
VERGLEICH
VON
REVERSER
UND
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
106
DJ
SPEZIESSPEZIFISCHE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
107
DJ
PRAXISTAUGLICHKEIT
MOLEKULARBIOLOGISCHER
METHODEN
108
5.1
SENSITIVITLTSBESTIMMUNG
108
5.1.1
FESTLEGUNG
EINER
AUSSCHLUSSGRENZE
FUER
REVERSE
UND
SANDWICH-HYBRIDISIERUNG
108
5.1.2
METHODIK
109
5.1.3
VERGLEICH
MIT
MIKROBIOLOGISCHEN
KULTURVERFAHREN
111
5.2
BEURTEILUNG
DER
ANGEWENDETEN
METHODEN
112
5.3
VERGLEICH
MIT
KOMMERZIELL
ERHAELTLICHEN
SYSTEMEN
112
E.
ZUSAMMENFASSUNG
114
E
LITERATURVERZEICHNIS
116
ANHANG
122
ERGEBNISSE
DER
SPEZIFITAETSTESTS
122
MESSWERTE
DER
REHYBRIDISIERUNG
127
ERGEBNISSE
DER
LAGERVERSUCHE
128
E
E
E
* |
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