Molekulargenetische Untersuchungen der DNA-Polymorphismen von TNF-Beta- und IL-2-Gen bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1.1 CHRONISCH ENTZUENDLICHE DANNERKRANKUNGEN 1
1.1.1 EPIDEMIOLOGIE 1
1.1.2 AETIOLOGIE 1
1.1.3 PATHOLOGIE 3
1.1.4 KLINIK 4
1.1.5 DIAGNOSTIK 6
1.1.6 THERAPIE 6
1.2 DASIMMUNSYSTEM 7
1.2.1 DAS SYSTEMISCHE IMMUNSYSTEM 7
1.2.2 DAS INTESTINALE IMMUNSYSTEM 9
1.3 IMMUNPATHOLOGIE BEI CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DARMERKRANKUNGEN 10
1.3.1 DIE VERAENDERUNG DES SYSTEMISCHEN IMMUNSYSTEMS
BEI CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DARMERKRANKUNGEN 10
1.3.2 DIE VERAENDERUNG DES INTESTINALEN IMMUNSYSTEMS
BEI CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DARMERKRANKUNGEN 11
1.4 ZYTOKINE 12
1.4.1 INTERLEUKIN-2 (EL-2) UND DER INTERLEUKIN-2-REZEPTOR (IL-2R) 13
1.4.2 TUMOR NEKROSE FAKTOR (TNF) 14
1.4.3 ANDERE MIT CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DARMERKRANKUNGEN
ASSOZIIERTEN ZYTOKINE 16
1.5 RESTRIKTIONS-FRAGMENT-LAENGEN-POLYMORPHISMUS (RFLP) 19
1.5.1 DER TNF-SS-NCOI-POLYMORPHISMUS 20
1.6 DAS PRINZIP DER POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 22
1.7 DAS PRINZIP DER EINZELSTRANG-KONFORMATIONS-POLYMORPHISMUS-
ANALYSE (SSCP) 24
2 ZIELSETZUNG 26
3 PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN
3.1 PATIENTEN UND KONTROLLKOLLEKTIV 27
3.2 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS VOLLBLUT 27
3.2.1 ISOLATION VON LEUKOZYTEN 27
3.2.2 LYSE DER LEUKOZYTEN 28
3.2.3 AUSSALZEN DER PROTEINE 28
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.2.4 FAELLEN DER DNA 28
3.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN IM SPEKTROPHOTOMETER 29
3.4 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 29
3.4.1 REAKTIONSKOMPONENTEN 30
3.4.
1.1
DNA-POLYMERASE 30
3.4.
1.2
DESOXYNUKLEOTID-T RIPHOSPHATE (DNTPS) 30
3.4.1.3 REAKTIONSPUFFER 30
3.4.
1
.4 PRIMER
31
3.4.
1
.5 VORLAGEN-DNA (TARGET-DNA) FUER DIE PCR
33
3.4.2 DURCHFUEHRUNG DER PCR
33
3.4.3 GELELEKTROPHORESE DER PCR-PRODUKTE 34
3.4.4 ASYMETRISCHE PCR
34
3.5 ISOLATION DER PCR-PRODUKTE UEBER AGAROSEGELELEKTROPHORESE 34
3.5.1 ELEKTROPHORESE IM LMP AGAROSEGEL
34
3.5.2 ISOLIERUNG DER PCR-PRODUKTE AUS DEM LMP-AGAROSEGEL
35
3.5.3 PHENOLEXTRAKTION
35
3.5.4 PRAEZIPITATION VON DNA
35
3.6 ENZYMATISCHE SPALTUNG DER PCR-PRODUKTE
DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
36
3.7 SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATIONAL POLYMORPHISM) 36
3.7.1 HERSTELLUNG DES POLYACRYLAMIDGELS 36
3.7.2 DENATURIERUNG DER PCR-PROBEN 38
3.7.3 DURCHFUEHRUNG DER SSCP
38
3.7.4 SILBERFAERBUNG DES SSCP-GELS 38
3.8 STATISTISCHES TESTVERFAHREN 38
3.9 MATERIAL
39
3.9.1 OLIGONUKLEOTIDE
39
3.9.2 ENZYME
40
3.9.3 REAGENTIEN 40
3.9.4 FOTOMATERIALIEN
41
3.9.5 PUFFERLOESUNGEN
41
3.9.6 LOESUNGEN FUER DIE SSCP-ANALYSE 42
4 ERGEBNISSE
4
.1
AMPLIFIKATION VON SEQUENZEN DER GENOMISCHEN DNA DES TNF-SS-GENS 43
4.2 VERTEILUNG DES TNF-SS-NCOI-POLYMORPHISMUS
IN EINER GESUNDEN KONTROLLGRUPPE
43
N
4.3 ASSOZIATION DES TNF-SS-NCOI-POLYMORPHISMUS
ZU CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DANNERKRANKUNGEN 45
4.3.1 MORBUS CROHN 45
4.3.2 COLITIS ULCEROSA 46
4.4 AMPLIFIKATION VON SEQUENZEN DER GENOMISCHEN DNA
AUS DEM EL-2-GEN 47
4.5 ETABLIERUNG DER SSCP-METHODE 48
4.5.1 LAUFTEMPERATUR
49
4.5.2 POLYACRYLAMIDGEL MIT GLYCEROL UND OHNE GLYCEROL 50
4.5.3 REINIGUNG DER PCR-PRODUKTE 51
4.5.4 SSCP-ANALYSE MIT SYMETRISCHER UND ASYMETRISCHER PCR 52
4.6 ERGEBNISSE DER SSCP-ANALYSE
54
5 DISKUSSION
5.1 DIE ROLLE VON IL-2 UND DES IL-2-GENS BEI DER PATHOGENESE
VON CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DARMERKRANKUNGEN 56
5.2 MOEGLICHE BEDEUTUNG DES TNF-SS-POLYMORPHISMUS BEI DER
PATHOGENESE VON CHRONISCH ENTZUENDLICHEN DARMERKRANKUNGEN 58
5.3 MOEGLICHE ANDERE MUTATIONEN ALS URSACHE VERAENDERTER TNF- UND
IL-2-EXPRESSION 61
6 ZUSAMMENFASSUNG 62
7 LITERATURVERZEICHNIS 63
8 ANHANG
8.1
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 78
8.2
TABELLENVERZEICHNIS
79
8.3 DANKSAGUNG 80
8.4 LEBENSLAUF 81
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