Charakterisierung von Sequenzmotiven für die Bindung des Zytoskelettproteins Protein 4.1 an den erythrozytären Anionenaustauscher:
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1997
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I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
SEITE
V
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DAS
MEMBRANZYTOSKELETT
DES
ERYTHROZYTEN
1
1.2
VERANKERUNG
DES
MEMBRANZYTOSKELETTS
DES
ERYTHROZYTEN
5
1.3
P4.
1
-MEMBRAN-INTERAKTIONEN
9
1.4
FRAGESTELLUNG
13
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
14
2.1
MATERIALEN
14
2.1.1
P4.1-CDNA
IM
PLASMIDVEKTOR
PGEM2
14
2.1.2
PLASMIDVEKTOR
PBHRESKRIPTSLC
15
2.1.3
PLASMIDVEKTOR
PUCMB20
15
2.1.4
PLASMIDVEKTOREN
PRSET
A,B,C
16
2.1.5
BAKTERIOPHAGE
ML
3
16
2.1.5.1
BAKTERIOPHAGE
M13KO7
17
2.1.5.2
BAKTERIOPHAGE
M13T7
17
2.1.6
BAKTERIENSTAEMME
17
2.1.7
OLIGONUKLEOTIDPRIMER
18
2.1.7.1
PRIMER
FUER
DIE
PUNKTMUTATION
DER
P4.
1
-CDNA
IM
LEEDY-MOTIV
18
2.1.7.2
PRIMER
FUER
DIE
HERSTELLUNG
DER
AE1-FUSIONSPROTEINE
18
2.1.8
ENZYME
19
2.1.9
PROTEASEINHIBITOREN
19
2.1.10
REAKTIONSKITS
19
2.1.11
DNA
UND
PROTEIN-MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
19
2.1.12
DETERGENZIEN
20
2.1.13
SULFHYDRYLREAGENZIEN
20
2.1.14
FARBSTOFFE/REAGENZIEN
FUER
DIE
PROTEINBESTIMMUNG
20
2.1.15
PROTEINE
20
2.1.16
SAEULENMATERIALIEN
20
2.1.17
REAGENZIEN
FUER
DIE
SDS-PAGE
20
II
2.1.18
REAGENZIEN
FUER
DIE
IMMUNREPLIK
UND
AUTORADIOGRAPHIE
21
2.1.19
DIVERSES
21
21.20
PUFFER/NAEHRMEDIEN
22
2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
23
2.2.1
GELELEKTROPHORESE
23
2.2.1.1
AGAROSEGEL
FUER
DNA
23
2.2.1.2
AGAROSEGEL
FUER
RNA
23
2.2.1.3
SEQUENZGEL
23
2.2.1.4
ANALYTISCHES
HAMSTOFFGEL
FUER
OLIGONUKLEOTIDE
24
2.2.2
FAERBEN
DER
AGAROSEGELE
MIT
ETHIDIUMBROMID
24
2.2.3
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
24
2.2.4
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
25
2.2.5
FAELLEN
VON
DNA
26
2.2.6
SPALTUNG
DER
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
26
2.27
ELUTION
VON
DNA
AUS
GELSTUECKEN
26
2.2.8
LIGATION
VON
DNA-FRAGEMENTEN
UND
PLASMIDVEKTOREN
27
2.2.9
UMKLONIEREN
VON
DNA
27
2.2.10
A-KOMPLEMENTATION/BLAU-WEISS-SELEKTION
REKOMBINANTER
KLONE
27
2.2.11
SELEKTION
REKOMBINANTER
KLONE
DURCH
HYBRIDISIERUNG
DER
PLASMID-DNA
28
2.2
11.1
UEBERFUEHRUNG
DER
BAKTERIENKOLONIEN
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
28
2.2.11
2
BAKTERIENLYSE
UND
FIXIERUNG
DER
BAKTERIEN
AUF
DER
MEMBRAN
28
2.2.11.3
HERSTELLUNG
DER
ECL-SONDE
28
2.2.11.4
HYBRIDISIERUNG
DER
DNA
29
22.11.5
ABBLOCKEN
DER
NITROZELLULOSE
UND
ANTIKOERPERINKUBATION
29
2.2.12
SCHNELLE
PLASMIDPRAEPARATION
I
(AMMONIUM-ACETAT-METHODE)
30
2.2.13
SCHNELLE
PLASMIDPRAEPARATION
II
30
2.2.14
PHENOLEXTRAKTION
30
2.2.15
DNA-MENGENBESTIMMUNG
31
2
2.16
DNA-SEQUENZIERUNG
(METHODE
NACH
SANGER)
31
2.2.17
INHIBITION
VON
RNASEN
DURCH
DEPC-BEHANDLUNG
32
2.2.18
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
32
2.2.19
IN
VITRO-TRANSLATION
33
2.2.20
PRAEPARATION
INFEKTIOESER
PHAGEN
(REPLIKATIVE
FORM)
33
III
2.2.21
PHAGENDICHTEBESTIMMUNG
34
23
MUTATION
DER
P4.1-CDNA
IM
LEEDY-MOTIV
34
2.3.1
UMKLONIERUNG
DER
P4.1-CDNA
34
2.3.2
TRANSFORMATION
IN
KOMPETENTE
BAKTERIEN
VOM
STAMM
CJ
236
35
2.3.3
HERSTELLUNG
URACILHALTIGER
DNA
(DOPPEL
UND
EINZELSTRANG)
35
2.3.4
KONTROLLE
DES
URACILEINBAUS
35
2.3.5
PHOSPHORYLIERUNG
DER
PRIMER
AM
5
'-ENDE
36
2.3.6
IN
VITRO-MUTAGENESE
36
2.3.7
TRANSFORMATION
DER
HYBRID-DNA
IN
E.
COLI
JM109
36
2.3.8
SEQUENZIERUNG
DER
DNA,
UMKLONIEREN
DER
MUTIERTEN
FRAGMENTE
37
2.3
9
HERSTELLUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
37
2.3.9.
I
FUSIONSPROTEINE
DER
NHJ-TERMINALEN
DOMAENE
VON
P4.
1
37
2.3.9.2
FUSIONSPROTEINE
VON
CD-AE
1
37
2.3.10
EXPRESSION
DER
FUSIONSPROTEINE
38
2
3.11
REINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
MIT
DER
IMAC-METHODE
38
(IMMOBILIZED
METAL
AFFINITY
CHROMATOGRAPHY)
2.4
BIOCHEMISCHE
METHODEN
40
2.4.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
40
2.4.2
AUFTROPFEN
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
40
2
4.3
SDS-PAGE
40
2.4.4
GESAMTPROTEINFAERBUNG
DER
POLYACRYLAMIDGELE
41
2.4.5
IMMUNREPLIKANALYSE
41
2.4.6
REINIGUNG
DER
HUMANEN
ERYTHROZYTENMEMBRAN
42
2.4.7
SPEKTRINEXTRAKTION/HERSTELLUNG
VON
LOV'S
42
2.4.8
EXTRAKTION
VON
P4.1
43
2.4.9
REINIGUNG
VON
CD-AE
1
44
2.4.10
BIOTINYLIERUNG
VON
P4.
1
44
2.4.11
NACHWEIS
VON
BIOTINYLIERTEN
PROTEINEN
45
2.4.12
AUSZAEHLEN
DER
RADIOAKTIVEN
ZERFAELLE
IM
SZINTILLATIONSZAEHLER
45
3.
ERGEBNISSE
46
3.1
MUTATION
DER
P4.1-CDNA
46
3.2
HERSTELLUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
47
IV
3.3
IMMUNREPLIKANALYSE
DER
FUSIONSPROTEINE
MIT
EINEM
POLYKLONALEN
P4.
1
-
48
ANTIKOERPER
UND
DEM
ANTUEDIOTYPISCHEN
ANTI-LEEDY-ANTIKOERPER
3.4
INVITRO-TRANSLATIONVONP4.R*,
P4.1
GB
,
P4.1
L
'
*
49
3.5
PROTEINBINDUNGSSTUDIEN
ZWISCHEN
CD-AE
1
UND
IN
VITRO-TRANSLATIERTEM
50
P4.1'*,
P4.1
OH
,
P4.1
L
"
3.6
PROTEINBINDUNGSSTUDIEN
ZWISCHEN
INVERTIERTEN
EXTRAHIERTEN
VESIKELN
(IOV
'S)
51
UND
IN
VITRO-TRANSLATIERTEM
RADIOAKTIV
MARKIERTEM
P4.
1
3.6.1
INHIBITION
DER
DER
P4.1-BINDUNG
AN
LOV'S
DURCH
EINEN
UEBERSCHUSS
AN
51
NATIVEM
P4.
1
3.6.2
VERGLEICH
DER
BINDUNG
VON
P4.1**UND
P4.1
L
'
*
AN
LOV'S
52
3.6.3
VERGLEICH
DER
BINDUNG
VON
P4.1**
UND
P4.1
*"
AN
LOV
'
S
54
3.6.4
VERGLEICH
DER
BINDUNG
VON
P4.1
"
*
UND
P4.1
GTA
AN
LOV'S
UNTER
ZUSATZ
54
VON
500
MM
KCL.
3.7
UNTERSUCHUNGEN
UEBER
DIE
ROLLE
DER
IRRRY
UND
LRRRY-MOTIVE
VON
55
CD-AE
1
MIT
HILFE
DER
FUSIONSPROTEINE
AE1-1,
AE1-2
UND
AE1-3
3.7.1
INHIBITION
DER
P4.1-BINDUNG
AN
EXTRAHIERTE
INVERTIERTE
VESIKEL
DURCH
ZU
55
SATZ
DER
FUSIONSPROTEINE
AE1-1
UND
AE1-3
3.7.2
BINDUNGSVERHALTEN
VON
PROTEIN
4.1
AN
DIE
FUSIONSPROTEINE
AE1-1
AE1-2
57
UND
AE1-3
SOWIE
NATIVE
CD-AE1
4.
DISKUSSION
5.
ZUSAMMENFASSUNG
6.
LITERATUR
8
8 |
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