Entwicklung retroviraler Vektoren für den Gentransfer in eukaryontische Zellen:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
MOEGLICHKEITEN
DER
SOMATISCHEN
GENTHERAPIE
1
1.1.1
BEHANDLUNG
VON
ERBKRANKHEITEN
IM
IMMUNSYSTEM
1
1.1.2
SOMATISCHE
GENTHERAPIE
VON
ZELLEN
AUSSERHALB
DES
IMMUNSYSTEMS
2
1.2
EINFUEHRUNG
NEUER
GENETISCHER
INFORMATION
2
1.2.1
SCHUTZ
VOR
PANZYTOPENIEN
DURCH
SOMATISCHEN
GENTRANSFER
2
1.2.2
AKTIVIERUNG
DER
TUMORIMMUNITAET
DURCH
SOMATISCHEN
GENTRANSFER
3
1.2.2.1
TRANSDUKTION
DER
TUMORZELLE
3
1.2.2.2
TRANSDUKTION
VON
TUMORINFILTRIERENDEN
LYMPHOZYTEN
(TIL)
4
1.2.2.3
TRANSDUKTION
VON
TUMORZELLEN
MIT
NEGATIVEN
SELEKTIONSMARKEM
4
1.3
TAXONOMIE
UND
AUFBAU
DER
RETROVIREN
6
1.3.1
EINTEILUNG
DER
RETROVIREN
6
1.3.1.1
DIE
AVIAN-LEUCOSIS-SARCOMA
VIRUS
(ALSV)
GRUPPE
7
1.3.1.2
DIE
C-TYP
VIRUSGRUPPE
7
1.3.1.3
DIE
B-TYP
VIRUS
GRUPPE
7
1.3.1.4
DIE
D-TYP
VIRUS
GRUPPE
8
1.3.
LENTI
VIREN
8
1.3.1.7
SPUMAVIREN
8
1.3.2
AUFBAU
DES
VIRION
8
1.3.2.1
ORGANISATION
DES
GENOMS
8
1.4
.
DER
RETROVIRALE
REPLIKATIONSZYKLUS
15
1.5
DIE
REVERSE
TRANSKRIPTION
17
1.6
DIE
INTEGRATION
DES
PROVIRUS
20
1.7
DIE
EXPRESSION
DES
PROVIRUS
21
1.8
RETRO
VIRALE
VEKTOREN
22
1.9
VERPACKUNGSZELLINIEN
ZUR
HERSTELLUNG
RETROVIRALER
VEKTOREN
23
1.10
DIE
CHRONISCHE
GRANULOMATOSE
26
1.11
DAS
PRINZIP
DER
GENTHERAPIE
31
1.12
PROBLEME
BEI
DER
DURCHFUEHRUNG
VON
GENTHERAPIEPROTOKOLLEN
31
1.13
RETROVIRALEN
GENTRANSFERS
32
1.14
RISIKEN
DES
RETROVIRALEN
GENTRANSFERS
32
1.15
VERBESSERUNGEN
IM
RETROVIRALEN
GENTRANSFER
33
1.16
NACHTEILE
BEIM
RETROVIRALEN
GENTRANSFER
33
1.17
DAS
KONZEPT
DER
SELBSTDELETIERENDEN
RETROVIRALEN
VEKTOREN
34
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
37
2.1
MATERIAL
37
2.1.1
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
37
2.1.2
MEDIEN
FILR
DIE
BAKTERIENKULTUR
38
2.1.3
VEKTOREN
38
2.1.4
KITS
UND
SAEULEN
39
2.1.5
GERAETE
40
2.1.6
ENZYME
40
2.1.7
NUKLEOTIDE
UND
OLIKONUKLEOTIDE
41
2.1.8
MARKER
UND
GROESSENSTANDARDS
41
2.1.9
BAKTERIENSTAEMME
41
2.1.10
MATERIAL
FILR
ARBEITEN
MIT
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
42
2.1.1
ALLGEMEIN
VERWENDETE
MATERIALIEN
UND
MEDIEN
42
2.2
METHODEN
43
2.2.1
PRAEPARATION
VON
DNA
43
2.2.1.1
ANALYTISCHE
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.COLI
43
2.2.1.2
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.COLI
44
2.2.1.3
PLASMID-MAXIPRAEPARATION
(PROTOKOLL
DER
FA.
QIAGEN)
46
2.2.2
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSMESSUNG
UND
BESTIMMUNG
DER
REINHEIT
VON
DNA-LOESUNGEN
47
2.2.3.1
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
48
2.2.3.2
AUFREINIGUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
48
2.2.4
SCHNEIDEN
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
48
2.2.5
'
BEHANDLUNG
VON
LINEARISIERTER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
49
2.2.6
AUFFUELLEN
VON
5
'
UEBERHAENGENDEN
DNA-ENDEN
49
2.2.7
GELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
50
2.2.7.1
ANALYTISCHE
UND
PRAEPARATIVE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
50
2.2.7.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
PRAEPARATIVEN
GELEN
MITTELS
DES
QIAEX-KITS
51
2.2.8
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
E.COLI
52
2.2.8.1
VORBEREITUNG
DES
ZU
MONIERENDEN
DNA-FRAGMENTS
53
2.2.8.2
LIGATION
VON
FRAGMENT
UND
VEKTOR
53
2.2.8.3
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
E.COLI-ZELLEN
54
2.2.8.4
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.COZI-ZELLEN
55
2.2.9
SEQUENZANALYSE
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
55
2.2.10
NACHWEIS
TRANSDUZIERTER
SEQUENZEN
MIT
HILFE
DER
PCR
58
2.2.11
NACHWEIS
DER
ANWESENHEIT
DER
REKOMBINASE
CRE
DURCH
DAS
REPORTER
PLASMID
PAMA
(FRED
SABLITZKY)
59
2.2.12
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
59
2.2.12.1
FUNKTIONSPRINZIP
DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
60
2.2.12.2
STREULICHT
60
2.2.12.3
FLUORESZENS
61
2.2.12.4
AUSWERTUNG
61
2.2.12.5
OBERFLAECHENMARKER-PHAENOTYPISIERUNG
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
62
2.2.12.5.1
PRINZIP
62
2.2.12.5.2
DURCHFUEHRUNG
63
2.2.13
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
MIT
HILFE
DES
YYQIAAMP
KITS
"
(FA.
QIAGEN)
63
2.2.14
TRANSFEKTION
DER
VERPACKUNGSZELLINIE
4
NX
UND
INFEKTION
VON
NIH
3T3
ZELLEN
64
2.2.15
ETABLIERUNG
VON
STABIL
TRANSFIZIERTEN
GPAML2
VERPACKUNGSZELLINIEN
66
2.2.16
X-GAL-FAERBUNG
VON
ADHAERENTEN
ZELLEN
67
2.2.17
NACHWEIS
DER
NADPH-OXIDASE
AKTIVITAET
DURCH
DEN
NBT
TEST
67
2.2.17.1
L'ORBEREITUNG
DER
ZELLEN
67
2.2.17.2
NBT
TEST
68
3.
ERGEBNISSE
69
3.2
ZIELSETZUNG
DER
PROMOTIONSARBEIT
69
3.2
ENTWICKLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
VEKTORS
CLP-PGK-LNGFR
70
3.3
KLONIERUNGSSTRATEGIE
70
3.4
KLONIERUNG
VON
PBS-PGK-LNGFR
71
3.5
KLONIERUNG
VON
CLP-PGK-LNGFR
73
3.6
UEBERPRUEFUNG
DER
FUNKTIONALITAET
DES
CLP-PGK-LNGFR
KONSTRUKTS
75
3.7
BESTIMMUNG
DER
INGFR
EXPRESSION
AUF
MIT
DEM
CLP-PGK-LNGFR
KONSTRUKT
TRANSIENT
TRANSFIZIERTEN
J
NX
ZELLEN
DURCH
FACS
MESSUNG
76
3.8
NACHWEIS
DER
CRE
EXPRESSION
DURCH
DAS
CLP-PGK-LNGFR
KONSTRUKT
IN
4
NX
ZELLEN
77
3.9
NACHWEIS
DER
TRANSDUKTION
VON
NIH
3T3
ZELLEN
DURCH
DEN
VEKTOR
CLP-PGK-LNGFR
78
3.10
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
INGFR
AUF
DEN
TRANSIENT
TRANSDUZIERTEN
NIH
3T3
ZELLEN
79
3.11
VERGLEICH
DER
INGFR
EXPRESSION
IN
TRANSDUZIERTEN
NIH
3T3
ZELLEN
DURCH
CLP
UND
PBABE
VEKTOREN
80
3.12
HERSTELLUNG
VON
PBABE-PGK-LNGFR
(ANHE
I/SAC
I)
81
3.13
BESTIMMUNG
DER
INGFR
EXPRESSION
AUF
F
N
ZELLEN
DURCH
DAS
KONSTRUKT
84
PBABE-PGK-LNGFR
(ANHE
I/SAC
I)
84
3.14
NACHWEIS
DER
TRANSDUKTION
VON
NIH
3T3
ZELLEN
MIT
DEM
PBABE-PGK-LNGFR
VEKTOR
85
3.15
QUANTIFIZIERUNG
DER
INGFR
EXPRESSION
AUF
NIH
3T3
ZELLEN,
DIE
MIT
DEM
VEKTOR
PBABEPGK-LNGFR
(ANHE
I/SAC
I)
TRANSDUZIERT
WURDEN
86
3.16
KLONIERUNGSSTRATEGIE
DES
KONSTRUKTS
CLP-PGK-GP91-IRES-LNGFR
88
3.17
KLONIERUNG
DER
ZWISCHENSTUFE
PBS-GP91-IRES-LNGFR
88
3.18
KLONIERUNG
VON
PBS-GP91
91
3.19
KLONIERUNG
VON
PBS-PGK-GP91
91
3.20
KLONIERUNG
VON
PBS-PGK-GP91-IRES-LNGFR
94
3.21
KLONIERUNG
VON
CLP-PGK-GP91-IRES-LNGFR
96
3.22
NACHWEIS
DER
CRE
AKTIVITAET
AUS
DEM
KONSTRUKT
CLP-PGK-GP91
IRES-LNGFR
IN
TRANSIENT
TRANSFIZIERTEN
HELA
ZELLEN
100
3.23
NACHWEIS
DER
INGFR
EXPRESSION
DURCH
CLP-PGK-GP91-IRES-LNGFR
103
3.24
ETABLIERUNG
EINER
STABIL
TRANSFIZIERTEN
VERPACKUNGS
ZELLINIE
GP
AM
1
2-CLP-PGK-GP9
1
-IRES-LNGFR
104
3.25
NACHWEIS
DER
CLP-PGK-GP91-IHRES-LNGFR
VEKTOR
INTEGRATION
IN
NIH
3T3ZELLEN
106
3.26
MESSUNG
DER
NADPH
OXIDASE
AKTIVITAET
IN
MIT
DEM
CLP-PGK-GP91
IRES-LNGFR
VEKTOR
TRANSDUZIERTEN
X-CGD
PLB
985
ZELLEN
108
3.27
CHARAKTERISIERUNG
DER
PGK-GP91-IHRES-LNGFR
EXPRESSIONSKASSETTE
IN
EINEM
ENHANCER/PROMOTORDELETIERTEN
PBABE
VEKTOR
109
3.28
KLONIERUNG
VON
PBABE-PGK-IHRES-LNGFR
(ANHE
I/SAC
1)
110
3.29
KLONIERUNG
DES
VEKTORKONSTRUKTS
PBABE-PGK-GP91-IRES-LNGFR
PBABE-GP91-IRES-LNGFR
(ANHE
I/SAC
I)
112
3.30
ETABLIERUNG
VON
MIT
DEN
PBABE-PGK-GP91-IHRES-LNGFR
KONSTRUKTEN
STABIL
TRANSFIZIERTEN
GPJML2
HELFERZELLINIEN
114
3.31
NACHWEIS
DER
VIRUSINTEGRATION
DER
PBABE-PGK-GP91
-IRES-LNGFR
NIH
3T3
ZELLEN
115
3.32
MESSUNG
DER
INGFR
EXPRESSION
AUF
MIT
DEN
PBABE-PGK-GP91-IRES-LNGFR
VEKTOREN
TRANSDUZIERTEN
ZELLEN
116
3.33
RETRO
VIRALE
EXPRESSION
EINES
CREER
FUSIONSPROTEINS
DURCH
EINEN
CMV
MINIMALPROMOTOR
117
3.34
KLONIERUNG
VON
PCDNA3CREER
(ECOR
I/ECOR
I)
119
3.35
KLONIERUNG
VON
PBABE
CMV
CREER
(SIN)
121
3.36
TEST
AUF
CRE
AKTIVITAET
DURCH
DAS
PBABE
CMV
CREER
(SIN)
KONSTRUKT
IN
|
NX
ZELLEN
123
4.
DISKUSSION
124
4.1
VORTEILE
UND
NACHTEILE
DES
RETROVIRALEN
GENTRANSFERS
124
4.2
DIE
PROBLEMATIK
DER
ENTSTEHUNG
VON
REPLIKATIONS
KOMPETENTEN
RETROVIREN
124
4.3
GEFAHR
DER
NEOPLASTISCHEN
TRANSFORMATION
DURCH
INSERTIONS
MUTAGENESE
125
4.4
NOTWENDIGKEIT
DES
MONITORINGS
VON
VIRUSUEBERSTAND
BEI
GENTHERAPEUTISCHEN
PROTOKOLLEN
126
4.5
DIE
PROBLEMATIK
DER
EXPRESSIONSREPRESSION
BEI
RETROVIRALEN
VEKTOREN
126
4.6
DIE
VERBESSERUNGEN
DES
RETROVIRALEN
GENTRANSFERS
DURCH
V
ERWENDUNG
SELBSTDELETIERENDER
V
EKTOREN
127
4.7
ERGEBNISSE
DER
ARBEIT
127
4.8
VERGLEICH
DES
EXPRESSIONSVERHALTENS
DER
KONSTRUKTE
PBABE-PGK-LNGFR
UND
CLP-PGK-LNGF
128
4.9
ZUKUENFTIGE
ARBEITEN
MIT
DEN
VEKTOREN
PBABE-PGK-LNGFR
UND
CLP-PGK-LNGFR
128
4.10
CHARAKTERISIERUNG
DER
VEKTOREN
PBABE-PGK-GP9
1
-IRES-LNGFR
UND
CLP-PGK-GP91-IRES-LNGFR
130
4.11
ZUKUENFTIGE
ARBEITEN
ZUR
EXPRESSION
VON
GP91
DURCH
CLP
VEKTOREN
132
4.12
DIE
VERWENDUNG
EINES
CREER-FUSIONSPROTEINS
IN
INDUZIERBAREN
RETROVIRALEN
VEKTOREN
132
4.13
PROBLEME,
DIE
BEIM
GENTRANSFER
MIT
SELBSTDELETIERENDEN
VEKTOREN
AUFTRETEN
KOENNEN
134
5.
ZUSAMMENFASSUNG
135
6.
LITERATURVERZEICHNIS
137
7.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
8.
LEBENSLAUF |
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