Isolierung und Charakterisierung thermostabiler Enzyme des Nukleinsäure-Metabolismus aus Thermus aquaticus:
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| Format: | Buch |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS
VERWENDETER
ABKUERZUNGEN
I
HINWEISE
ZUR
NOMENKLATUR
III
1
EINLEITUNG
1
1.1
THENNOPHILE
ORGANISMEN
DER
GATTUNG
THERMUS
1
1.2
ENZYME
IM
NUKLEINSAEUREMETABOLISMUS
2
1.2.1
DNA-ABHAENGIGE
RNA-POLYMERASE
(EC
2.7.7.6.)
UND
PROKARYOTISCHE
TRANSKRIPTION
2
1.2.2
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
(EC
3.1.3.1)
5
1.2.3
SAURE
PHOSPHATASE
(EC
3.1.3.2)
7
1.2.4
NUKLEASEN
8
2
PROBLEMSTELLUNG
9
3
ERGEBNISSE
11
3.1
THERMUS
AQUATICUS
ZELLKULTUR
11
3.2
2D-ELEKTROPHORETLSCHE
TRENNUNG
VON
GESAMTZELL-LYSATEN
UND
DNA-AFFTNEN
PROTEINFRAKTIONEN
AUS
T.
AQUATICUS
13
3.2.1
PROBENVORBEREITUNG
13
3.2.2
TRENNBEDINGUNGEN
15
3.3
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
ENZYMS
DNA-ABHAENGIGE
RNA
POLYMERASE
AUS
THERMUS
AQUATICUS
18
3.3.1
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
18
3.3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
UNTEREINHEITEN
22
3.3.3
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
24
3.3.4
GENETISCHE
LOKALISIERUNG
MITTELS
DEGENERIERTER
SONDEN
IM
SOUTHEM-BLOT
30
3.3.5
ENZYMATISCHE
AKTIVITAET
REKONSTITUIERTER
UNVOLLSTAENDIGER
ENZYMKOMPLEXE
32
3.3.6
IN-VITRO-TRANSKRIPTION
IM
HOMOLOGEN
UND
HETEROLOGEN
SYSTEM
34
3.4
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
ENZYMS
ALKALISCHE
PHOPHATASE
AUS
THERMUS
AQUATICUS
48
3.5
VERSUCHE
ZUR
ISOLIERUNG
DES
ENZYMS
SAURE
PHOSPHATASE
AUS
THERMUS
AQUATICUS
54
3.6
VERSUCHE
ZUR
ISOLIERUNG
VON
NUKLEASEN
AUS
T.
AQUATICUS
57
3.7
N-TERMINALE
SEQUENZ
EINES
BEI
30%
(NEDJSCLSAT.
UEBERREPRAESENTEN
T.
AQUATICUS
PROTEINS
58
4
DISKUSSION
60
5
ZUSAMMENFASSUNG
75
6
EXPERIMENTELLER
TEIL
78
6.1
GERAETE
UND
CHEMIKALIEN
78
6.2
ALLGEMEINE
HINWEISE
80
6.3
ALLGEMEINE
METHODEN
81
6.3.1
DNA-ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIEN
81
6.3.2
DNA-EXTRAKTION
AUS
AGAROSEGELEN
84
6.3.3
PCR
84
6.3.4
RESTRIKTIONSSPALTUNG
86
6.3.5
FAELLUNGSMETHODEN
87
6.3.6
DIALYSE,
UMPUFFEM
89
6.3.7
GELELEKTROPHORESE
89
6.3.8
MEMBRANTRANSFER
95
6.3.9
GEL
UND
MEMBRANFAERBUNG,
CHEMILMNINESZENZBLOT
97
6.3.10
DNA-SEQUENZIERUNG
102
6.3.11
CHROMATOGRAPHIE
106
6.3.12
PROTEINASSAY
110
6.3.13
PROTEINSEQUENZIERUNG
110
6.4
BAKTERIENKULTUREN
ESCHERICHIA
COLI
UND
THERMUS
AQUATLCUS
114
6.4.1
BAKTERIENSTAEMME
114
6.4.2
MEDIEN
115
6.4.3
ZELLKULTUR
UND
ZELLEMTE
117
6.4.4
GLYCEROLPRAEPARATION
ZUR
LANGZEITLAGERUNG
VON
ZELLKULTUREN
118
6.5
2D-ELEKTROPHORESE
118
6.5.1
ANALYTISCHE
2D-ELEKTROPHORESE
118
6.5.2
PRAEPARATIVE
2D-ELEKTROPHORESE
123
6.6
ENZYMISOLIERUNG
125
6.6.1
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DES
ENZYMS
DNA-ABHAENGIGE
RNA-POLYMERASE
AUS
ESCHERICHIA
COLIHBLOL
125
6.6.2
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DES
ENZYMS
DNA-ABHAENGIGE
RNA-POLYMERASE
AUS
THERMUS
AQUATICUS
YT-1
128
6.6.3
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DES
ENZYMS
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
AUS
THERMUS
AQUATICUS
YT-1
129
6.6.4
VERSUCHE
ZUR
ISOLIERUNG
DES
ENZYMS
SAURE
PHOSPHATASE
AUS
T.
AQUATICUS
YT-1
131
6.6.5
VERSUCHE
ZUR
ISOLIERUNG
VON
NUKLEASEN
AUS
T.
AQUATICUS
YT-1
132
6.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
RNA-POLYMERASE
AUS
T.
AQUATICUS
133
6.7.1
REKONSTITUTION
DER
RNA-POLYMERASE
AUS
IHREN
UNTEREINHEITEN
133
6.7.2
GENETISCHE
LOKALISIERUNG
MITTELS
SOUTHEMBLOT
136
6.7.3
HOMOLOGE
UND
HETEROLOGE
IN-VITRO-TRANSKRIPTION
138
7
LITERATURVERZEICHNIS
142
8
ANHANG
151
8.1
ABLEITUNG
DEGENERIERTER
DNA-SONDEN
FUER
DEN
SOUTHEMBLOT
AUS
N-TERMINALEN
PROTEINSEQUENZEN
151
8.2
DNA
UND
PLASMID-SEQUENZEN
153 |
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