Chemisch synthetisierte Ribooligonukleotide mit modifizierten Basen: Sekundärstrukturuntersuchungen und Affinitätsmarkierung
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
|
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| Beschreibung: | Bayreuth, Univ., Diss., 1998 |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
INHALTSVERZEICHNIS
.
III
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VIII
1.
EINLEITUNG
.
I
1.1
CHEMISCHE
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
RIBONUKLEINSAEUREOLIGO
NUKLEOTIDEN
.
1
1.1.1
CHEMISCHE
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
2
1.1.1.1
DIE
ANFAENGE
.
2
1.1.1.2
DIE
AUTOMATISIERTE
SYNTHESE
AN
DER
FESTEN
PHASE
.
3
1.1.1.3
DIE
H-PHOSPHONATMETHODE
.
5
1.1.1.4
DIE
SYNTHESE
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
6
1.1.2
REINIGUNG
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
IM
GROSSEN
MASSSTAB
.
7
1.2
SEKUNDAERSTRUKTUREN
VON
KURZEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
7
1.3
PHOTOREAKTIVE
NUKLEOTIDE
FUER
QUERVERNETZUNGSREAKTIONEN
.
9
1.4
DER
FUER
SELENOCYSTEIN
SPEZIFISCHE
ELONGATIONSFAKTOR
SELB
.
11
1.5
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
13
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
15
2.1
MATERIALIEN
UND
GERAETE
.
15
2.1.1
GERAETE
.
15
2.1.2
ENZYME
UND
PROTEINE
.
15
2.1.3
RADIOCHEMIKALIEN
.
15
2.1.4
CHEMIKALIEN
.
15
2.1.5
SAEULEN
UND
CHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN
.
16
2.1.6
CHEMISCH
SYNTHETISIERTE
RIBOOLIGONUKLEOTIDE
.
16
2.2
METHODEN
.
17
2.2.1
ALLGEMEINES
.
17
2.2.1.1
ABSORPTIONSMESSUNG
.
17
2.2.1.1.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
18
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.1.2
AUFNAHME
VON
UV-SPEKTREN
.
18
2.2.1.2
ZENTRIFUGATIONEN
.
18
2.2.1.3
FAELLUNGEN
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
18
2.2.1.4
FAERBUNG
VON
PROTEIN
UND
NUKLEINSAEUREBANDEN
IN
GELEN
.
19
2.2.1.4.1
YYSTAINS
ALL
"
-FAERBUNG
VON
RNA
(DAHLBERG
ET
AL.,
1969)
.
19
2.2.1.4.2
YYCOOMASSIE
"
-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
(SAMBROOK
ET
AL.,
1989)
.
19
2.2.1.4.3
SILBER-FAERBUNG
(BLUM
ET
AL.,
1987)
.
19
2.2.2
GELELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
20
2.2.2.1
GELE
FUER
RNA
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
20
2.2.2.2
GELE
FUER
RNA
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
20
2.2.2.3
NATIVE
GELE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
WECHSELWIRKUNG
DER C-TERMINALEN
DOMAENE
VON
SELB
MIT
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
.
.
21
2.2.2.4
PROTEINGELE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
21
2.2.2.4.1
SDS-GELE
NACH
LAEMMLI
(1970)
.
21
2.2.2.4.2
SDS-GELE
NACH
SCHAEGGER
UND
VON
JAGOW
(1987)
.
22
2.2.3
CHEMISCHE
SYNTHESE
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
22
2.2.3.1
AUTOMATISIERTER
SYNTHESEZYKLUS
AN
DER
FESTEN
PHASE
.
22
2.2.3.2
OXIDATION
DER
H-PHOSPHONATRIBOOLIGONUKLEOTIDE
.
23
2.2.3.3
ENTSCHUETZEN
DER
RNA
.
23
2.2.4
REINIGUNG
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
23
2.2.4.1
PRAEPARATIVE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
24
2.2.4.1.1
GELELEKTROPHORESE
.
24
2.2.4.1.2
ELUTION
DER
RNA
AUS
DEM
GEL
.
24
2.2.4.2
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNGSMETHODEN
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
24
2.2.4.2.1
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
FPLC
.
25
2.2.4.2.2
UMKEHRPHASEN-CHROMATOGRAPHIE
MITTELS
HPLC
.
25
2.2.4.2.3
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
HPLC
.
25
2.2.4.2.4
PRAEPARATIVE
REINIGUNG
VON
RNA
MITTELS
HPLC
UEBER
EINE
NUCLEOGEN
500-7-DEAE-SAEULE
.
26
2.2.5
ANALYTIK
AN
RNA-MOLEKUELEN
.
26
2.2.5.1
ANALYTISCHE
GELELEKTROPHORESE
.
27
2.2.5.2
ANALYTISCHE
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
HPLC
.
27
2.2.5.3
MALDI-MS
MIT
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
27
2.2.5.4
ANALYSE
VON
NUKLEOSIDEN
MITTELS
HPLC
.
28
2.2.5.4.
1
SPALTUNG
DER
RNA
ZU
NUKLEOSIDEN
.
28
2.2.5.4.2
TRENNUNG
DER
NUKLEOSIDE
DURCH
HPLC
(MODIFIZIERT
NACH
GEHRKE
ET
AL.,
1982)
.
28
2.2.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
RNA
AM
5'-ENDE
.
29
2.2.7
DETEKTION
VON
RADIOAKTIVITAET
.
29
2.2.8
QUERVEMETZUNGSREAKTIONEN
VON
MIT
5-IODURIDIN
MARKIERTER
RNA
MIT
PROTEINEN
.
29
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.8.1
QUERVEMETZUNG
DES
HUELLPROTEINS
DES
BAKTERIOPHAGEN
R17
NACH
WILLIS
ET
AL.
(1993)
.
29
2.2.8.2
QUERVERNETZUNGEN
DES
FUER
SELENOCYSTEIN
SPEZIFISCHEN
ELONGATIONS
FAKTORS
SELB
MIT
DER
ENTSPRECHENDEN
BINDESEQUENZ
DER
MRNA
.
30
2.2.8.2.1
KOMPLEXBILDUNG
DER
RNA
MIT
SELB
.
30
2.2.S.2.2
NACHWEIS
DER
KOMPLEXBILDUNG
DER
SELB-PROTEINE
MIT
DER
RNA
.
30
2.2.8.2.3
QUERVEMETZUNGEN
AM
HECD-LASER
.
30
2.2.8.2.4
QUERVEMETZUNGEN
AM
UV-TRANSILLUMINATOR
.
31
2.2.8.2.5
ANALYTISCHER
NACHWEIS
DES
QUERVEMETZUNGSPRODUKTES
.
31
2.2.8.2.OE
PEPTIDSPALTUNG
DES
QUERVEMETZUNGSPRODUKTES
.
31
2.2.8.2.7
ANALYTIK
DER
GESPALTENEN
PEPTIDE
.
32
2.2.9
'H-NMR
SPEKTROSKOPIE
.
33
2.2.9.1
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
.
33
2.2.9.2
NMR-MESSUNGEN
.
33
3.
ERGEBNISSE
.
35
3.1
CHEMISCHE
SYNTHESE,
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
UND
ANALYTIK
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
35
3.1.1
REINIGUNG
DER
CHEMISCH
SYNTHETISIERTEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDE
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
.
35
3.1.1.1
REINIGUNG
VON
RNA-MOLEKUELEN
MITTELS
FPLC
.
36
3.1.1.2
REINIGUNG
VON
RNA-MOLEKUELEN
MITTELS
HPLC
.
38
3.1.2
PRAEPARATIVE
REINIGUNG
DER
RNA
UEBER
EINE
NUCLEOGEN
500-7-DEAE
HPLC-SAEULE
.
45
3.1.3
ANALYTIK
AN
GEREINIGTEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
48
3.1.3.1
ANALYSE
DER
NUKLEOSIDZUSAMMENSETZUNG
DER
RNA
MITTELS
HPLC
.
48
3.1.3.2
ANALYSE
DER
MASSE
DER
CHEMISCH
SYNTHETISIERTEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDE
DURCH
MALDI-MS
.
52
3.2
SEKUNDAERSTRUKTURUNTERSUCHUNGEN
AN
VOM
"PPC-BEREICH
DER
TRNA^
ABGELEITETEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
54
3.2.1
SYNTHESE
DER
VON
DER
TRNA
A,A
ABGELEITETEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDE
.
54
3.2.2
SEKUNDAERSTRUKTURUNTERSUCHUNGEN
MITTELS
'H-NMR-SPEKTROSKOPIE
.
56
3.2.2.1
EINFLUSS
DER
LOOPGROESSE
AUF
DIE
SEKUNDAERSTRUKTUR
.
56
3.2.2.2
DER
EINFLUSS
DER
LOOPSEQUENZ
AUF
DIE
SEKUNDAERSTRUKTUR
.
58
3.2.3
SEKUNDAERSTRUKTURUNTERSUCHUNGEN
MIT
NATIVEN
GELEN
.
66
3.2.3.1
DER EINFLUSS
DER
LOOPSEQUENZ
AUF
DIE
SEKUNDAERSTRUKTUR.
66
3.2.3.2
DIE
KINETIK
DER
UMWANDLUNG
VOM
HAIRPIN
ZUM
DUPLEX
.
67
3.2.3.3
DIE
ABHAENGIGKEIT
DER
DIMERISIERUNG
VON
DER
KONZENTRATION
.
69
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3.4
DIE
DIMERISIERUNG
DER
MIKROHELIX-AU59
IN
GEGENWART
VON
TRINUKLEOTIDEN
.
71
3.3
AFFINITAETSMARKIERUNG
UND
QUERVERNETZUNGSREAKTIONEN
VON
CHEMISCH
SYNTHETISIERTER
RNA
MIT
PROTEINEN
.
73
3.3.1
GEHALT
AN
5-IODURIDIN
IN
DEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
73
3.3.2
VORVERSUCHE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
REAKTIVITAET
DES
I
5
U
AM
HECD
LASER
.
73
3.3.3
QUERVEMETZUNG
VON
MIT
I
5
U
MARKIERTER
RNA
MIT
PROTEINEN
.
78
3.3.3.1
DAS
HUELLPROTEIN
DES
R17-BAKTERIOPHAGEN
ALS
POSITIVKONTROLLE
.
79
3.3.3.2
DER
FUER
SELENOCYSTEIN
SPEZIFISCHE
ELONGATIONSFAKTOR
SELB
.
80
3.3.3.2.1
QUERVEMETZUNGEN MIT
DEM
SELB-PROTEIN
.
82
3.3.3.2.2
QUERVEMETZUNGEN
MIT
DER
C-TERMINALEN
DOMAENE
VON
SELB
.
84
4.
DISKUSSION
.
91
4.1
REINUGUNG
UND
ANALYTIK
VON
CHEMISCH
SYNTHETISIERTEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
91
4.1.1
REINIGUNG
VON
CHEMISCH
SYNTHETISIERTEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
IN
FUER
STRUKTURANALYSEN
ERFORDERLICHEN
MENGEN
.
91
4.1.1.1
EINE
REINIGUNG
MITTELS
FPLC
FUEHRT
NICHT
ZU
SAUBEREN
PRODUKTEN
.
92
4.1.1.2
REINIGUNGEN
MITTELS
UMKEHRPHASENCHROMATOGRAPHIE
FUEHREN
NICHT
IN
ALLEN
FAELLEN
ZU
SAUBERER
RNA
.
92
4.1.1.3
DIE
REINIGUNG
DER
RNA
AN
DEAE-ANIONENAUSTAUSCHSAEULEN
MIT
GROSSER
PORENGROESSE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
LIEFERT
HOMOGEN
ZUSAMMENGESETZTE
RNA
.
93
4.1.2
ANALYTIK
AN
GEREINIGTEN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
94
4.1.2.1
2'-5'-VERKNUEPFUNGEN
IN
DER
CHEMISCH
SYNTHETISIERTEN
RNA
KONNTEN
AUSGESCHLOSSEN
WERDEN
.
94
4.1.2.2
MODIFIZIERTE
BASEN
KONNTEN
SPEZIFISCH
IN
RIBOOLIGONUKLEOTIDE
EINGEBAUT
WERDEN
.
95
4.2
SEKUNDAERSTRUKTURDIMORPHISMUS
VON
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.
96
4.2.1
DIE
SCHRITTWEISE
VERKUERZUNG
DER
LOOPSEQUENZ
VON
SIEBEN
AUF
VIER
NUKLEOTIDE
FUEHRT
ZUR
STABILISIERUNG
DES
HAIRPINS
.
98
4.2.2
DIE
ANZAHL
DER
SELBSTKOMPLEMENTAEREN
BASEN
IM
LOOP
STEUERT
DIE
DIMERISIERUNGSGESCHWINDIGKEIT
.
100
4.3
QUERVEMETZUNG
VON
MIT
I
S
U
MARKIERTER
RNA
MIT
PROTEINEN
.
105
4.3.1
EINBAU
UND
REAKTIVITAET
VON
I
5
U
IN
RIBOOLIGONUKLEOTIDEN
.105
4.3.2
QUERVEMETZUNG
VON
MIT
I
5
U
MARKIERTER
RNA
MIT
DEM
R17-HUELLPROTEIN.L08
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.3
QUERVEMETZUNG
VON
MIT
I
5
U
MARKIERTER
RNA
MIT
SELB
.
109
4.3.3.1
DIE
QUERVEMETZUNG
IST
UNABHAENGIG
VON
DER
ART
DES
GUANIN
NUKLEOTIDES,
DAS
AN
DEN
SELB
GEBUNDEN
IST
.
109
4.3.3.2
DIE
POSITION
DER
PHOTOAKTIVEN
BASE
IN
DER
RNA
HAT
NUR
GERINGEN
EINFLUSS
AUF
DIE
QUERVEMETZUNGSAUSBEUTEN
.
110
4.3.3.3
DIE
LOOP-SEQUENZ
DES
HAIRPINS
UND
DAS
AUSGEKLAPPTE
URIDIN
IM
STAMM
HABEN
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
QUERVEMETZUNG
.
111
4.3.3.4
DIE
QUERVEMETZUNG
FUEHRT
AUCH
MIT
DEM
R17-RNA-HAIRPIN
ZUM
ERFOLG
.111
4.3.3.5
DIE
PEPTIDSEQUENZ,
DIE
BEI
DER
QUERVEMETZUNG
REAGIERT
HAT,
WURDE
EINGEGRENZT
.
112
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
115
6.
SUMMARY
.
117
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
118
8.
ANHANG
.
129
8.1
MOLARE
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
VON
NUKLEOSIDEN
.
129
8.2
MASSEN
VON
NUKLEOTIDMONOPHOSPHATEN
.
130
ERKLAERUNG
.
131
DANKSAGUNG
.
132 |
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