Synthese und Charakterisierung von cholesterinmodifizierten Hammerhead-Ribozymen:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Göttingen
Cuvillier
1998
|
Ausgabe: | 1. Aufl. |
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Beschreibung: | VI, 142 S. graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
RIBOZYME
.
1
1.2
DAS
HAMMERHEAD-RIBOZYM
.
1
1.3
DIE
HAMMERHEAD-KONSENSUS-SEQUENZ
.
2
1.4
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DES
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
.
4
1.5
MECHANISMUS
UND
STEREOCHEMISCHER
VERLAUF
DER
SPALTUNG
.
5
1.6
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
HAMMERHEAD-RIBOZYMEN
.
8
1.6.1
KINETIK
DER
ELEMENTAREN
REAKTIONSSCHRITTE
.
9
1.7
EINFLUSS
VON
RNA-SEKUNDAERSTRUKTUREN
AUF
DIE
KATALYTISCHE
EFFIZIENZ
.
11
1.8
WIRKUNGSMECHANISMEN
FUER
DIE
INHIBITION
VIRALER
GENEXPRESSION
.
11
1.9
ENDOGENE
APPLIKATION
VON
RIBOZYMEN
.
12
1.10
EXOGENE
APPLIKATION
VON
RIBOZYMEN
.
13
1.11
THEMENSTELLUNG
.
15
2.
ERGEBNISSE
.
16
2.1
SYNTHESEN
VON
CHOLESTERIN-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMEN
.
16
2.2
VERKNUEPFUNG
MIT
CHOLESTERIN-PHOSPHORAMIDITEN
.
16
2.2.1
SYNTHESE
VON
(RP/SP)-[O-(4',4"-DIMETHOXYTRIPHENYLMETHYL)-BIS
(6-HYDROXYHEXYL)
DISULFID]-0-(2-CYANOETHOXY
N,
N'-DIISO
PROPYLAMINO)PHOSPHAN
(4A,B)
.
18
2.2.2
SYNTHESE
VON
(RP/SP)-[L-(6-HYDROXYHEXYL)-3-CHOLESTERYLDISULFID]
O-(2-CYANOETHOXY)-N,
N'-DIISOPROPYLAMINOPHOSPHAN
(9A,B)
.
19
2.2.3
SYNTHESE
VON
RIBOZYM-CHOLESTERYL-KONJUGATEN
MIT
CHOLESTERIN-PHOSPHORAMIDITEN.
20
2.3
SYNTHESE
VON
TERMINALEN
PHOSPHOROTHIOAT-OLIGONUKLEOTIDEN
UND
DEREN
UMSETZUNG
MIT
CHOLESTERINDERIVATEN
.
21
2.3.1
SYNTHESE
DER
VERSCHIEDENEN
CHOLESTERINDERIVATE
.
23
2.3.1.1
SYNTHESE
VON
OT-BROMOACETAMID-3-CHOLESTERIN
(18)
.
23
2.3.1.2
SYNTHESE
VON
VERSCHIEDEN
AKTIVIERTEN
THIOCHOLESTERINEN
.
24
2.3.2
REAKTIONEN
MIT
THYMIDIN-3'-PHOSPHOROTHIOAT
.
25
2.3.3
SYNTHESE
DES
OLIGODESOXYNUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
III,C
.
26
2.3.3.1
REAKTIONEN
DES
OLIGODESOXYNUKLEOTID-3'
PHOSPHOROTHIOATS
III,C
.
28
2.3.4.
SYNTHESE
VON
OLIGODESOXYNUKLEOTID-5'-PHOSPHOROTHIOATEN
.
29
2.3.4.1
REAKTIONEN
DES
OLIGODESOXYNUKLEOTID-5'
PHOSPHOROTHIOATS
IV,C
.
31
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.5
VERSUCH
DER
SYNTHESE
VON
OLIGORIBONUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATEN
.
32
2.3.6
SYNTHESE
VON
URIDIN-3'-PHOSPHOROTHIOAT
.
33
2.3.6.1
ABSPALTUNG
DER
2
'-SILYLSCHUTZGRUPPE
.
33
2.3.6.2
REAKTION
VON
URIDIN-3'-PHOSPHOROTHIOAT
MIT
BIS(4-NITROPHENYL)-DISULFID-3
,3
'-DICARBONSAEURE
.
34
2.3.7.
SYNTHESE
DES
OLIGORIBONUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
V,C
.
35
2.3.7.1
REAKTION
DES
OLIGORIBONUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
V,C
MIT
A-BROMOACETAMID-3-CHOLESTERIN
.
36
2.3.8
VERSUCH
DER
SYNTHESE
VON
RIBOZYM-3'-PHOSPHOROTHIOATEN
.
36
2.4
REAKTION
VON
2'-AMINO
ODER
5'-AMINOLINKER-MODIFIZIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
ISOTHIOCYANAT
UND
ISOCYANATCHOLESTERINDERIVATEN
.
36
2.4.1
SYNTHESEN
DER
ISOTHIOCYANAT
UND
ISOCYANATCHOLESTERINDERIVATE
.
37
2.4.1.1
SYNTHESE
VON
3-ISOTHIOCYANATBENZYL-3-CHOLESTERYL-DISULFID
(22)
.
37
2.4.1.2
SYNTHESE
VON
3A-ISOTHIOCYANATCHOLESTERIN
(23)
.
38
2.4.1.3
SYNTHESE
VON
3A-ISOCYANATCHOLESTERIN
(24)
.
38
2.4.1.4
SYNTHESE
VON
2-ISOCYANATETHYL-3-CHOLESTERYLDISULFID
(26)
.
39
2.4.2
REAKTIONEN
MIT
DEM
2'-AMINOURIDIN-MODIFIZIERTEN
OLIGORIBONUKLEOTID
VI,
A
.
40
2.4.2.1
REAKTION
DES
2'-AMINOURIDIN-MODIFIZIERTEN
OLIGORIBO
NUKLEOTIDS
VI,A
MIT
VERSCHIEDENEN
CHOLESTERINDERIVATEN
.
40
2.4.3
REAKTIONEN
EINES
5'-AMINOLINKER-MODIFIZIERTEN
OLIGODESOXY
NUKLEOTIDS
VII,A
MIT
VERSCHIEDENEN
CHOLESTERINDERIVATEN.
41
2.4.4
VERSUCH
DER
SYNTHESE
EINES
5'-AMINOLINKER-MODIFIEZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
.
41
2.4.5
SYNTHESE
VON
2'-AMINOCYTIDIN
MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-
RIBOZYMEN
UND
DEREN
REAKTION
MIT
ISOCYANATCHOLESTERINDERIVATE
.
42
2.4.6
SYNTHESE
VON
2'-FLUOR,
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-
RIBOZYMEN
UND
DEREN
REAKTION
MIT
ISOCYANATCHOLESTERINDERIVATE.
44
2.5
ENZYMKINETIKEN
.
46
2.5.1
MICHAELIS-MENTEN-KINETIK
.
47
2.5.2
HERLEITUNG
DER
SINGLE-TURNOVER-GLEICHUNG
.
49
2.6
KINETIK
DER
SPALTUNG
VON
TRANSKRIPTEN
MIT
HAMMERHEAD-RIBOZYMEN
.
51
2.6.1
SPALTUNG
DER
LTR-RNA
DURCH
VERSCHIEDENE
RIBOZYME
.
51
2.6.2
SPALTUNG
DES
LUC-TRANSKRIPTS
DURCH
VERSCHIEDEN
RIBOZYME
.
53
3.
DISKUSSION
.
55
3.1
DERIVATISIERUNG
MIT
CHOLESTERINPHOSPHORAMIDITEN
.
57
3.2
SYNTHESE
VON
TERMINALE
PHOSPHOROTHIOAT-OLIGONUKLEOTIDEN
UND
DEREN
REAKTION
MIT
CHOLESTERINDERIVATEN.
58
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.3
ISOCYANAT-METHODIK
.
61
3.4
KATALYTISCHE
AKTIVITAET
DER
EINZELNEN
RIBOZYME
.
61
3.5
EINFLUSS
CHEMISCHE
MODIFIKATIONEN
AUF
DIE
KATALYTISCHE
AKTIVITAET
DER
RIBOZYME
.
62
3.6
AUSBLICK
.
64
4.
EXPERIMENTELLER
TEIL
.
65
4.1
LOESUNGSMITTEL
UND
REAGENZIEN
.
65
4.2
GERAETE
.
67
4.3
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
67
4.4
ENZYME
.
67
4.5
PLASMIDE
.
67
4.6
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
68
4.7
METHODEN
.
69
4.7.1
SCHMELZPUNKTE
.
69
4.7.2
SPEKTROSKOPIE
.
70
4.7.2.1
UV-SPEKTROSKOPIE
.
70
4.7.2.2
NMR-SPEKTROSKOPIE
.
70
4.7.3
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
70
4.7.3.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
70
4.7.3.2
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
70
4.7.3.3
HIGH
PERFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
.
71
4.7.4
GELELEKTROPHORESE
.
72
4.8
SYNTHESEN
.
73
4.8.1
SYNTHESE
VON
PHOSPHORAMIDITEN
.
73
4.8.2
SYNTHESE
VON
CHOLESTERINDERIVATEN
FUER
DIE
REAKTION
MIT
OLIGO
NUKLEOTID-PHOSPHOROTHIOATEN
.
79
4.8.3
SYNTHESEN
VON
CHOLESTERYLDERIVATEN
FUER
DIE
UMSETZUNG
MIT
2'-NH2-MODIFIZIERTEN
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
.
85
4.9
OLIGONUKLEOTIDE
.
91
4.9.1
ALLGEMEINE
ARBEITSVORSCHRIFTEN
.
91
4.9.2
OLIGODESOXYNUKLEOTID-SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
.
91
4.9.3
SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
VON
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
.
91
4.9.4
RADIOAKTIVE
5
'-MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
93
4.9.5
RADIOAKTIVE
3
'-MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
93
4.9.6
IN-VITRO
TRANSKRIPTION
MIT
RADIOAKTIVER
MARKIERUNG
.
94
4.9.7
SPALTUNGSKINETIK
DER
LUC
UND
LTR-TRANSKRIPTE
.
95
4.10
SYNTHESE
VON
RIBOZYM-CHOLESTERIN-DERIVATEN
UEBER
DIE
PHOSPHORAMIDITMETHODE
.
96
4.11
TERMINALE
PHOSPHOROTHIOATE
.
98
4.11.1
REAKTIONEN
MIT
THYMIDIN-3
'-PHOSPHOROTHIOAT
.
98
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.12
SYNTHESE
UND
REAKTION
TERMINALER
PHOSPHOROTHIOAT-OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
101
4.12.1
SYNTHESE
DES
OLIGODESOXYNUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
III,C
.
101
4.12.1.1
REAKTIONEN
DES
OLIGODESOXYNUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
III,C
.
103
4.12.2
SYNTHESE
DES
01IGODESOXYNUKLEOTID-5'-PHOSPHOROTHIOATS
IV,C
.
105
4.12.2.1
REAKTIONEN
DES
OLIGODESOXYNUKLEOTID-5'-PHOSPHOROTHIOATS
IV,C
.
106
4.12.3
SYNTHESE
DES
01IGORIBONUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
V,C
.
108
4.12.3.1
REAKTION
DES
OUEGONUKLEOTID-3'-PHOSPHOROTHIOATS
V,C
MIT
OT-BROMOACETAMID-3-CHOLESTERIN
.
110
4.13
REAKTIONEN
VON
2
'-AMINO
UND
5'-AMINOLINKER-MODIFIZIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
VERSCHIEDENEN
ISOTHIOCYANAT
UND
ISOCYANATCHOLESTERINDERIVATEN.
HO
4.13.1
SYNTHESE
DES
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
OLIGORIBONUKLEOTIDS
VI,A
.
HO
4.13.1.1
REAKTIONEN
DES
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
OLIGORIBONUKLEOTIDS
VI,
A
.
111
4.13.2
SYNTHESE
DES
5'-AMINOLINKER-MODIFIZIERTEN
OLIGODESOXYNUKLEOTIDS
VII,
A
.
112
4.13.2.1
REAKTIONEN
DES5'-AMINO-MODIFIZIERTEN
OLIGODESOXYNUKLEOTIDSVII,A
.
113
4.13.3
SYNTHESE
DES
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
VIH,A
.
114
4.13.3.1
REAKTIONEN
DES
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
VIII,A
.
114
4.13.4
SYNTHESE
DES
2'-FLUOR,
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
IX,A
.
115
4.13.4.1
REAKTIONEN
DES
2'-FLUOR,
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-
RIBOZYMS
IX,A
.
116
4.13.5
SYNTHESE
DES
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
X,A
.
117
4.13.5.1
REAKTIONEN
DES
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-
RIBOZYMS
X,A
.
117
4.13.6
SYNTHESE
DES
2'-FLUOR,
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-RIBOZYMS
XI,A
.
118
4.13.6.1
REAKTIONEN
DES
2'-FLUOR,
2'-AMINO-MODIFIZIERTEN
HAMMERHEAD-
RIBOZYMS
XI,
A
.
119
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
120
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
122
7.
ANHANG
.
135
8.
LEBENSLAUF
.
143 |
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