Charakterisierung der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) in hämatopoietischen Zellen:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DAS
HAEMATOPOIETISCHE
SYSTEM
.
1
1.2
PHOSPHATASEN
.
3
1.2.1
SAURE
PHOSPHATASEN
.
4
1.2.1.1
TARTRAT-RESISTENTE
SAURE
PHOSPHATASE
.
5
1.3
EISEN-REGULIERTE
PROTEINE
.
8
1.3.1
REGULATION
UEBER
"IRON-RESPONSIVE
ELEMENTS"
.
8
1.3.2
REGULATION
DURCH
HAEM/PROTOPORPHYRIN
IX
.
10
1.4
ZIELSETZUNG
UND
AUFGABENSTELLUNG
.
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1
ZELLKULTURTECHNIK
.
13
2.1.1
PERMANENTE
ZELLINIEN
.
13
2.1.1.1
VERWENDETE
ZELLINIEN
.
13
2.1.1.2
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
.
13
2.1.1.3
PASSAGIEREN
.
14
2.1.1.4
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
UND
VIABILITAET
.
15
2.1.1.5
EINFRIEREN
VON
ZELLINIEN
.
15
2.1.1.6
AUFTAUEN
VON
ZELLINIEN
.
16
2.1.1.7
MYKOPLASMEN-DETEKTION
UND
-KURIERUNG
.
16
2.1.2
GENTRANSFER-METHODEN
.
19
2.1.2.1
STABILE
EXPRESSION
.
19
2.1.2.2
TRANSIENTE
EXPRESSION
.
20
2.1.2.3
ZELLEMTE
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
20
2.2
PROTEINANALYTIK
.
21
2.2.1
PROTEINBESTIMMUNG
.
21
2.2.2
NACHWEIS
DER
CHLORAMPHENICOL-ACETYLTRANSFERASE
(CAT)
.
21
2.2.3
BESTIMMUNG
DER
LUZIFERASE-AKTIVITAET
.
22
2.2.4
BESTIMMUNG
DER
SS-GALACTOSIDASE-AKTIVITAET
.
23
2.3
ARBEITEN
MIT
ESCHERICHIA
COLI
.
24
2.3.1
E
COLI
STAEMME
.
24
II
2.3.2
KULTURMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
.
24
2.3.3 KULTIVIERUNG
VON
E.
COLI
.
24
2.3.4
KONSERVIERUNG
VON
BAKTERIENKOLONIEN
.
25
2.3.5
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
25
2.3.6
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
DURCH
ELEKTROPORATION
.
25
2.4
ALLGEMEINE
METHODEN
ZUR
HANDHABUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
26
2.4.1
STERILISIEREN
.
26
2.4.2
PHENOLEXTRAKTION
.
26
2.4.3
ETHANOLPRAEZIPITATION
.
27
2.4.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
27
2.5
GELELEKTROPHORESEN
.
27
2.5.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
27
2.5.2
DENATURIERENDE
AGAROSEGELE
.
28
2.5.3
SEQUENZIERGELE
.
29
2.6
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITEN
.
30
2.6.1
NUKLEINSAEURE-PRAEPARATION
.
30
2.6.1.1
PRAEPARATION
HOCHMOLEKULARER
DNA
(HMW-DNA)
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
30
2.6.1.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
.
31
2.6.1.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
.
31
2.6.1.4
RNA-PRAEPARATION
.
33
2.6.1.5
PRAEPARATION
VON
POLY(A)
+
-RNA
.
34
2.7
/N-VZ/RO-ARBEITEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
.
35
2.7.1
RESTRIKTIONSANALYSE
VON
DNA
.
35
2.7.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
35
2.7.3
AUFFULLREAKTION
5-UEBERSTEHENDER
ENDEN
(KLENOW-REAKTION)
.
36
2.7.4
T4
DNA-POLYMERASE-REAKTION
ZUR
HERSTELLUNG
VON
"BLUNT
ENDS"
.
36
2.7.5
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
37
2.7.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
38
2.7.6.1
"RANDOM-PRIMED
OLIGOLABELING"
.
38
2.7.6.2
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE-REAKTION
.
38
2.7.6.3
IN-VITRO
TRANSKRIPTION
.
39
2.7.6.4
ABTRENNUNG
FREIER
NUKLEOTIDE
.
40
2.7.6.5
TRICHLORESSIGSAEURE-(TCA)-FAELLUNG
ZUR
BESTIMMUNG
DES
RADIOAKTIVEN
EINBAUS
.
40
2.7.7
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
41
2.7.8
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEURESEQUENZEN
.
43
III
2.7.8.1
"
SOUTHEM-BLOTTING"
.
43
2.7.8.2
"NORTHEM-BLOTTING"
.
43
2.7.8.3
KOLONIE-FILTER-HYBRIDISIERUNG
.
44
2.7.8.4
FILTER-HYBRIDISIERUNG
.
45
2.7.9
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
46
2.7.9.1
ISOLIERUNG
DURCH
BINDUNG
AN
GLASMILCH
.
46
2.7.9.2
DNA-ISOLIERUNG
AUS
NIEDRIG
SCHMELZENDER
AGAROSE
.
47
2.7.10
DNA-SYNTHESE
.
47
2.7.10.1
OLIGONUKLEOTID-SYNTHESE
.
47
2.7.10.2
QUALITAETSBESTIMMUNG
DER
DNA-SYNTHESE
DURCH
FPLC
.
48
2.7.11
SL-NUKLEASE
KARTIERUNG
.
49
2.7.12
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
50
2.7.13
RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)
.
52
2.7.14
EYOIII/SL
DELETIONEN
.
54
2.8
ENZYMATISCHER
NACHWEIS
DER
TRAP
.
55
2.8.1
ANALYTISCHE
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
.
55
2.8.2
ZYTOCHEMISCHE
FAERBUNG
DER
TRAP
.
57
2.9
VERWENDUNG
VON
PLASMIDEN
UND
OLIGONUKLEOTIDEN
.
58
2.9.1
VERWENDETE
PLASMIDE
.
58
2.9.2
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
62
2.9.2.1
ALLGEMEIN
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
62
2.9.2.2
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
SEQUENZIERUNGEN
.
62
2.9.2.3
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
PCR-REAKTIONEN
.
62
2.9
2.4
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
KLONIERUNGEN
.
63
2.10
GERAETE
UND
CHEMIKALIEN
.
64
2.10.1
GERAETE
.
64
2.10.2
CHEMIKALIEN
.
65
2.10.3
ENZYME
.
65
3
ERGEBNISSE
.
66
3.1
ISOLIERUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
DES
HUMANEN
TRAP-GENS
.
66
3.1.1
COSMID-SCREENING
.
66
3.1.1.1
UEBERPRUEFUNG
AUF
VOLLSTAENDIGKEIT
DES
TRAP-GENS
.
67
3.1.2
ERSTELLUNG
EINER
RESTRIKTIONSKARTE
DES
COSMID-KLONS
H3
.
69
3.1.3
SUBKLONIERUNG
DER
TRANSKRIPTIONSEINHEIT
UND
DER
5'-REGION
.
69
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
HUMANEN
TRAP-GENSTRUKTUR
.
71
3.2.1
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
KODIERENDEN
REGION
.
71
3.2.2
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
5'-FLANKIERENDEN
REGION
.
72
3.2.3
BESTIMMUNG
DER
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTE
.
76
IV
3,3
EXPRESSION
DER
TRAP
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
PROMOTORS
.
77
3.3.1
EXPRESSION
DER
TRAP
IM
GEWEBE
.
77
3.3.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
PROMOTORS
.
81
3.3.2.1
KONSTRUKTION
EINES
STILLEN
LUZIFERASE-VEKTORS
.
81
3.3.2.2
MESSUNG
DER
KONSTITUTIVEN
PROMOTORAKTIVITAET
.
83
3.3.2.3
DELETIONSMUTAGENESE
DES
TRAP
5'-BEREICHES
.
84
3.4
BETEILIGUNG
DER
TRAP
AM
EISEN-METABOLISMUS
.
86
3.4.1
EINFLUSS
DES
EISENGEHALTES
DER
ZELLE
AUF
DIE
TRAP-GENEXPRESSION
.
87
3.4.2
REGULATION
DER
TRANSLATION?
.
90
3.4.3
REGULATION
DER
TRANSKRIPTION
DURCH
EISEN
.
93
3.4.3.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
IN
DIE
HUMANEN
ZELLINIEN
293
UND
HT
1080
.
94
3.4.4
SUCHE
NACH
EISEN-REGULIERTEN
ELEMENTEN
.
95
3.4.5
REGULATION
UEBER
"HEMIN
RESPONSIVE
ELEMENTS"?
.
97
3.4.5.1
EINFLUSS
VON
HEMIN
AUF
DIE
REGULATION
DER
PROMOTORAKTIVITAET
DURCH
"HEMIN
RESPONSIVE
ELEMENTS"
.
100
3.4.6
SPEZIES-SPEZIFITAET
DES
HUMANEN
UND
MURINEN
TRAP-PROMOTORS
.
101
3.4.6.1
STABILE
TRANSFEKTION
IN
HOMOLOGE
UND
HETEROLOGE
SYSTEME
.
102
4
DISKUSSION
.
104
4.1
EXPRESSIONSMUSTER
DER
TRAP
IN
HAEMATOPOIETISCHEN
ZELLEN
.
104
4.2
AUFKLAERUNG
DER
STRUKTUR
DES
HUMANEN
TRAP-GENS
.
106
4.2.1
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZAUFKLAERUNG
.
107
4.2.2
STARTPUNKT
DER
TRANSKRIPTION
.
107
4.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
PROMOTORBEREICHES
.
108
4.3
REGULATION
DER
TRAP-GENEXPRESSION
.
113
4.3.1
DIE
TRAP-EXPRESSION
IST
ABHAENGIG
VOM
INTRAZELLULAEREN
EISENGEHALT
.
114
4.3.2
TRANSKRIPTIONALE
REGULATION
DER
TRAP-EXPRESSION
DURCH
EISEN
.
114
4.3.3
"HEMIN
RESPONSIVE
ELEMENTS"
.
116
4.3.4
ANSATZ
ZUR
ERKLAERUNG
DER
TRAP-FUNKTION
-
EIN
MODELL
.
118
5
LITERATURVERZEICHNIS
.
121
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
134
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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