Klonierung einer Adenylatcyclase aus Paramecium:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Tübingen
MVK, Medien-Verl. Köhler
1997
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Literaturverz. S. 175 - 183 |
| Beschreibung: | 184 S. graph. Darst. |
| ISBN: | 3932694139 |
Internformat
MARC
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
CAMP
1
1.1.1
GENERELLES
1
1.1.2
WIRKUNG
VON
CAMP
DURCH
CAMP-ABHAENGIGE
PROTEINKINASEN
1
1.1.3
REGULATION
DURCH
DIREKTE
BINDUNG
VON
CAMP
2
1.2
ADENYLATCYCLASEN
3
1.2.1
KLASSEN
VON
ADENYLATCYCLASEN
3
1.2.2
ADENYLATCYCLASEN
VOM
TYP
DER
MAMMALIA-ACS
4
1.2.2.1
STRUKTUR
4
1.2.2.2
FUNKTION
5
1.2.2.3
REGULATION
6
1.3
CAMP
UND
ADENYLATCYCLASE
IN
PARAMECIUM
TETRAURELIA
7
2
MATERIAL
8
2.1
ALLGEMEINES
MATERIAL
8
2.1.1
VERBRAUCHSMATERIALIEN
8
2.1.2
GERAETE
10
2.2
LOESUNGEN
13
2.3
OLIGONUKLEOTIDE
(PRIMER)
19
3
METHODEN
25
3.1
PROZESSIERUNG
UND
ANALYSE
VON
DNA
25
3.1.1
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
25
3.1.2
ETHANOLFALLUNG
VON
DNA
25
3.1.3
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
25
3.1.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
26
3.1.5
PHOSPHORYLIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
UND
OLIGONUKLEOTIDEN
26
3.1.6
5'-DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
LINEARISIERTEN
VEKTOREN
26
3.1.7
VERDAU
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
27
3.1.8
GLAETTUNG
UEBERHAENGENDER
DNA-ENDEN
27
3.1.9
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
SANGER
27
3.1.10
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DN
A
MITTELS
ALF
28
3.2
NEUKOMBINATION
VON
DNA
29
3.2.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI-STAEMME
29
3.2.2
LIGATION
ZUR
HERSTELLUNG
VON
PLASMIDKONSTRUKTEN
29
3.2.3
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
30
3.2.3.1
SCHNELLTRANSFORMATION
30
3.2.3.2
STANDARDTRANSFORMATION
30
3.2.4
STANDARDPLASMIDPRAEPARATION
30
3.2.5
ANLEGEN
VON
BAKTERIENDAUERKULTUREN
31
3.3
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
31
3.3.1
PCR
MIT
DEN
OLIGONUKLEOTIDEN
SL,
S2
UND
AS1
ZUR
AMPLIFI
32
KATION
DES
ERSTEN
ADENYLATCYCLASEFRAGMENTS
AUS
PARAMECIUM
TETRAURELIA
51S
3.3.2
STANDARD-PCR
MIT
SPEZIFISCHEN
PRIMERN
32
3.3.3
LIGATION
VON
PCR-PRODUKTEN
IN
VEKTOREN
33
3.4
HERSTELLUNG
UND
DURCHMUSTERUNG
VON
GENBANKEN
33
3.4.1
HERSTELLUNG
EINER
GENOMISCHEN
DNA-BANK
AUS
P.
TETRAURELIA
51S
33
3.4.2
POLY(A)*-RNA-ISOLIERUNG
UND
HERSTELLUNG
EINER
CDNA-BANK
33
AUS
PARAMECIUM
TETRAURELIA
51S
3.4.3
HERSTELLUNG
VON
PHAGENPLATTEN,
TITERN
UND
AMPLIFIKATION
34
VON
GENBANKEN
3.4.3.1
KONDITIONIERUNG
VON
E.
COLI
ZUR
INFEKTION
MIT
AE-PHAGEN
34
3.4.3.2
HERSTELLUNG
VON
PHAGENPLATTEN
35
3.4.3.3
TITERM
VON
GENBAMKEN
UND
PHAGENSUSPENSIONEN
35
3.4.3.4
AMPLIFIKATION
VON
GENBANKEN
35
3.4.4
GENBANKDURCHMUSTERUNG
MITTELS
PCR
36
3.4.5
GENBANKDURCHMUSTERUNG
MITTELS
EINER
RADIOAKTIVEN
SONNDE
36
3.4.5.1
HERSTELLUNG
DER
SONDE
36
3.4.5.2
DURCHFUEHRUNG
DER
ERSTEN
DURCHMUSTERUNG
36
3.4.5.3
ZWEITE
DURCHMUSTERUNG
37
3.4.5.4
IN
VIVO
EXCISION
38
3.4.6
SOUTHERN
BLOT
MIT
PLASMID-DNA
38
3.5
GEZIELTE
MUTAGENESE
39
3.6
EXPRESSION
IN
SAEUGERZELLEN
40
3.6.1
COS-ZELLEN
40
3.6.1.1
ZUECHTEN
VON
COS-ZELLEN
40
3.6.1.2
TRANSFEKTION
VON
COS-ZELLEN
MIT
DEAE-DEXTRAN,
40
MODIFIZIERT
NACH
(125)
3.6.1.3
DEAE-DEXTRAN-METHODE
NACH
CULLEN
41
3.6.1.4
METHODE
NACH
LABORPROTOKOLL
VON
FLOCKERZI
41
3.6.2
HEK
293-ZELLEN
41
3.6.2.1
ZUECHTEN
VON
HEK
293
41
3.6.2.2
STABILE
TRANSFEKTION
VON
HEK
293
NACH
DER
CALCIUM
42
PHOSPHATMETHODE
3.6.3
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
42
3.6.4
BESTIMMUNG
DER
ADENYLATCYCLASEAKTIVITAET
43
3.6.4.1
HERSTELLUNG
VON
ZELLHOMOGENATEN
43
3.6.4.2
PROTEINBESTIMMUNG
43
3.OE.4.3
ENZYMTEST
43
3.6.5
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
45
3.7
ANTIKOERPER
46
3.7.1
VERSUCHE
MIT
PEPTIDANTIKOERPERN
46
3.7.1.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
PEPTIDEN
46
3.7.1.2
KONSTRUKTION
VON
PET!6B-PEP3,
EXPRESSION
UND
46
WERTERN-SS/OT-ANALYSE
3.7.2
EXPRESSION
DES
ANTIGENS
ZUR
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
48
4
ERGEBNISSE
49
4.1
KLONIERUNG
EINER
ADENYLATCYCLASE
AUS
PARAMECIUM
TETRAURELIA
51S
49
4.1.1
ERLAEUTERUNGEN
49
4.1.2
ISOLIERUNG
EINES
PCR-FRAGMENTS
AUS
GESCHERTER
52
GENOMISCHER
DNA
4.1.3
HERSTELLUNG
UND
DURCHMUSTERUNG
EINER
GENOMISCHEN
DNA-BANK:
54
ISOLIERUNG
VON
G-KLON
1
4.1.4
SUCHE
NACH
DER
AC
AUS
PARAMECIUM
IN
BEREITS
VORHANDENEN
55
CDNA-BANKEN
4.1.5
HERSTELLUNG
EINER
CDNA-BANK
AUS
PARAMECIUM
TETRAURELIA
51S
56
4.1.6
DURCHMUSTERUNG
DER
CDNA-BANK
AUS
4.1.5:
57
ISOLIERUNG
VON
C-KLON
1
4.1.7
ERWEITERN
DER
SEQUENZINFORMATION
DURCH
DURCHMUSTERUNG
DER
59
GENOMISCHEN
DNA-BANK:
FISCHEN
VON
G-KLON
2
4.1.8
WEITERE
DURCHMUSTERUNG
DER
CDNA-BANK:
59
AUFFINDEN
VON
C-KLON
2
4.1.9
IDENTIFIZIERUNG
DES
STARTCODONS:
ISOLIERUNG
VON
G-KLON
3
61
4.1.10
IDENTIFIZIERUNG
WEITERER
INTRONS
IN
DER
CODIERENDEN
REGION
70
DER
PARAMECIUM-AC
4.1.11
ABSICHERUNG
DER
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
ADENYLATCYCLASE
AUS
71
PARAMECIUM
4.1.11.1
ISOLIERUNG
VON
C-KLON
3
71
4.1.11.2
UEBERPRUEFUNG
DER
A-INSERTION
BEI
NT
5754
72
4.1.12
EIN
UNGEWOEHNLICHES
PCR-PRODUKT
72
4.1.13
DIE
NAECHSTE
MRNA
UPSTREAM
DES
STARTCODONS
DER
73
PARAMECIUM-AC
4.2
ANALYSE
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
DER
PARAMECIUM-AC
75
4.2.1
AEHNLICHKEIT
DER
ERSTEN
DOMAENE
ZU
EL-E2-ATPASEN
75
4.2.2
ANALYSE
DER
ADENYLATCYCLASEDOMAENE
82
4.2.3
TOPOLOGIE
DER
ADENYLATCYCLASE
AUS
PARAMECIUM
88
4.2.4
POTENTIELLE
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN,
ERKENNUNGSMOTIVE
92
4.2.4.1
ASPARAGINGLYCOSYLIERUNG
92
4.2.4.2
PKA-PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
92
4.2.4.3
ANDERE
POTENTIELLE
MODIFIKATIONSSTELLEN
93
4.2.4.4
ERKENNUNGSSEQUENZ
FUER
SERPINE
93
4.3
WEITERE
ADENYLATCYCLASEN
AUS
PARAMECIUM
TETRAURELIA
51S
94
4.3.1
VERSUCH
DER
REPRODUKTION
EINES
WEITEREN
VON
RUSSELL
94
GEFUNDENEN
PCR-PRODUKTS
4.3.2
AMPLIFIKATION
ZWEIER
WEITERER
DNA-FRAGMENTE
MIT
AEHNLICHKEIT
94
ZU
ADENYLATCYCLASEN
4.4
UMSCHREIBEN
DES
GENETISCHEN
CODES
98
4.4.1
MUTAGENESESTRATEGIE
99
4.4.2
UMWANDLUNG
DER
TAA
UND
TAG-CODONS
101
IN
FRAGMENT
C
(NT
5361
-
6005)
4.5
EXPRESSIONSVERSUCHE
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLKULTUREN
104
4.5.1
HERSTELLUNG
EINES
VEKTORS
ZUR
EXPRESSION
DER
ADENYLAT
104
CYCLASEDOMAENE
IN
COS-ZELLEN
4.5.2
EXPRESSIONSVERSUCHE
IN
COS-ZELLEN
114
4.5.2.1
ERSTE
EXPERIMENTE
MIT
COS-1
ZELLEN
114
4.5.2.2
VERSUCHE
MIT
COS-7
ZELLEN
114
4.5.2.3
TRANSFEKTION
VON
COS-7
ZELLEN
MIT
EXPRESSIONSVEKTOREN
115
FUER
ADENYLATCYCLASEN
4.5.3
TRANSFEKTION
VON
HEK
293-ZELLEN
116
4.6
ANTIKOERPER
120
4.6.1
PEPTIDANTIKOERPER
120
4.6.2
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
C
LB
-BEREICHS
DER
ADENYLAT
121
CYCLASEDOMAENE
5
DISKUSSION
124
5.1
KLONIERUNG
124
5.2
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
PARAMECIUM-AC
125
5.3
STRUKTUR
DER
PARAMECIUM-AC
125
5.4
AMINOSAEURESEQUENZ
DER
PARAMECIUM-AC
126
5.4.1
LONENTRANSFEREINHEIT
126
5.4.2
ADENYLATCYCLASEDOMAENE
127
5.4.3
SEQUENZVERGLEICH
ZWISCHEN
PARAMECIUM-AC
UND
129
TETRAHYMENA-AC
5.4.3.1
LONENTRANSFEREINHEIT
129
5.4.3.2
ADENYLATCYCLASEDOMAENE
132
5.5
ISOFORMEN
135
5.6
EXPRESSIONSVERSUCHE
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLKULTUREN
137
5.7
ANTIKOERPER
140
5.8
MOEGLICHE
FUNKTIONSWEISE
DER
PARAMECIUM-AC
141
6
ZUSAMMENFASSUNG
143
7
ANHANG
145
7.1
TABELLE
DER
IM
TEXT
ERWAEHNTEN
PROTEINE
AUS
DEN
SWISSPIR-DATENBANKEN
145
7.2
BLASTP-SUCHE
MIT
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
DER
LONENTRANSFEREINHEIT
147
7.3
BLASTP-SUCHE
MIT
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
DER
ADENYLATCYCLASEDOMAENE
151
7.4
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
IN
DEN
KONSERVATIVEN
KATALYTISCHEN
157
BEREICHEN
DER
ADENYLATCYCLASEDOMAENE
DER
PARAMECIUM-AC
MIT
DEN
ADE
NYLATCYCLASEN
HOEHERER
EUKARYONTEN
7.4.1
SEQUENZVERGLEICH
IM
C|
A
-BEREICH
158
7.4.2
SEQUENZVERGLEICH
IM
C
2A
-BEREICH
160
7.5
BLASTP-SUCHE
MIT
DEN
GEFUNDENEN
NUKLEOTIDYLATCYCLASEFRAGMENTEN
162
7.5.1
G240AC
162
7.5.2
G270AC
164
7.6
CDNA-SEQUENZ
DER
GEFUNDENEN
CYSTEINPROTEASE
166
7.7
BLASTP-SUCHE
MIT
DER
AMINOSAEURESEQUENZ,
DIE
AUF
DEM
GEFUNDENEN
167
CDNA-FRAGMENT
OBERHALB
DER
PARAMECIUM-AC
CODIERT
IST
7.8
VERGLEICH
VON
PARAMECIUM-AC,
G240AC
UND
G270AC
AUF
169
DNA-EBENE
7.9
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
VON
PARAMECIUM-AC
UND
170
TETRAHYMENA-AC
MIT
DEM
CLUSTAL-PROGRAMM
8
LITERATURVERZEICHNIS
175 |
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