Cytochrom P450-Enzyme aus Papaver somniferum L.: Klonierung und heterologe Expression
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
.
1
II.
MATERIAL
.
27
1.
PFLANZEN
.
27
2.
BAKTERIEN
.
28
3.
HEFEN
UND
INSEKTENZELLEN
.
29
4.
NUKLEINSAEUREN
UND
NUKLEOTIDE
.
29
5.
ENZYME
UND
ENZYMKITS
.
31
6.
CHEMIKALIEN
.
32
7.
GERAETE
.
34
8.
SONSTIGES
.
36
IH.
METHODEN
.
37
1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
37
1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
37
1.2
ISOLIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
.
39
1.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
39
1.4
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
.
41
1.5
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
43
2.
KONSTRUKTION
UND
DURCHMUSTERUNG
EINER
CDNA-BIBLIOTHEK
.
43
2.1
KONSTRUKTION
EINER
LAMBDA
ZAPII-BIBLIOTHEK
.
43
2.2
DURCHMUSTERUNG
DER
LAMBDA
ZAPII-BIBLIOTHEK
(SCREENING)
.
45
3.
SUBKLONIERUNGEN
.
47
3.1
AUSSCHNEIDEN
DES
PBLUESCRIPT-PLASMIDS
AUS
DER
LAMBDA-
ZAPH-DNA
.
47
3.2
HYDROLYSE
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
48
INHALTSVERZEICHNIS
3.3
LIGATIONEN
.
49
4.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
50
4.1
STANDARDREAKTION
.
50
4.2
PCR
MIT
RNA
(RT-PCR)
.
52
5.
ELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
53
5.1
TRENNUNG
VON
RNA
UEBER
AGAROSEGELE
.
53
5.2
TRENNUNG
VON
DNA
UEBER
AGAROSEGELE
.
55
5.3
TRENNUNG
VON
DNA
UEBER
POLYACRYLAMIDGELE
.
.
.
56
6.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
(CYCLE
SEQUENCING)
.
57
7.
BLOTTING-TECHNIKEN
.
58
7.1
NORTHEM-BLOTTING
.
58
7.2
SOUTHEM-BLOTTING
.
59
8.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
59
8.1
ENDMARKIERUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
59
8.2
MARKIERUNG
VON
DNA
NACH
DER
FEINBERG-VOGELSTEIN-TECHNIK
.
60
9.
HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
.
60
9.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
.
60
9.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
CDNA-PROBEN
.
62
10.
TRANSFORMATIONEN,
TRANSFEKTIONEN
UND
INFEKTIONEN
.
63
10.1
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIENZELLEN
.
63
10.2
TRANSFORMATION
VON
HEFEZELLEN
.
64
10.3
TRANSFEKTION
VON
INSEKTENZELLEN
.
65
10.3.1
KOTRANSFEKTION
VON
SPODOPTERA
FRUGIPERDA-ZEUEEN
MIT
EXPRESSIONSVEKTOR
UND
WILDTYP-BACULOVIRUS
.
65
10.3.2
TRANSFEKTION
VON
SPODOPTERA
FRUGIPERDA-ZELLEN
MIT
REKOMBINIERTEM
BACMID
.
67
10.4
INFEKTION
VON
INSEKTENZELLEN
UND
VIRUSVERMEHRUNG
.
68
11.
MIKROSOMENPRAEPARATIONEN
.
69
INHALTSVERZEICHNIS
11.1
GEWINNUNG
VON
HEFEZELLMIKROSOMEN
.
69
11.2
GEWINNUNG
VON
INSEKTENZELLMIKROSOMEN
.
71
12.
SPEKTRALPHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNGEN
.
71
12.1
PROTEINBESTIMMUNG
.
71
12.2
AUFNAHME
VON
CO-DIFFERENZSPEKTREN
.
72
13.
ENZYMTESTS
.
72
13.1
CYTOCHROM
P450-ENZYME
.
72
13.2
NADPH:CYTOCHROM
P450-REDUKTASE
.
76
IV.
ERGEBNISSE
.
77
1.
ISOLIERUNG
VON
CYTOCHROM
P450-CDNA-KLONEN
AUS
PAPAVER
SOMNIFERUM
L
.
77
1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
77
1.2
KLONIERUNG
VON
P450-CDNA-TEILFRAGMENTEN
.
78
1.3
ENTWURF
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
.
82
1.4
ANLEGEN
EINER
LAMBDA
ZAPII-BIBLIOTHEK
.
82
1.5
DURCHMUSTERN
DER
LAMBDA
ZAPII-BIBLIOTHEK
(SCREENING)
.
83
1.6
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA-KLONE
.
84
2.
ANALYSE
DER
CDNA-KLONE
DURCH
HYBRIDISIERUNG
.
93
2.1
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
.
93
2.2
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
.
95
3.
NACHWEIS
DER
KLONIERTEN
CYTOCHROM
P450-SEQUENZEN
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN
VON
PAPAVER
SOMNIFERUM
L.
MITTELS
RT-PCR
.
98
4.
HETEROLOGE
EXPRESSION
.
103
4.1
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
103
4.1.1
KONSTRUKTION
VON
EXPRESSIONSPLASMIDEN
.
103
4.1.1.1
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PY-PSOCYPL
.
103
4.1.1.2
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PY-PSOCYP2
.
104
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1.3
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PRS-PSOCPR
.
105
4.1.2
TRANSFORMATIONEN
.
109
4.1.3
NACHWEIS
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
ENZYME
.
110
4.1.3.1
AUFNAHME
VON
CO-DIFFERENZSPEKTREN
.
110
4.1.3.2
BESTIMMUNG
DER
CYTOCHROM
P450-REDUKTASE
.
112
4.1.3.3
ENZYMTESTS
.
113
4.2
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
SPODOPTERA
FRUGIPERDA
.
114
4.2.1
KONSTRUKTION
VON
EXPRESSIONSPLASMIDEN
.
114
4.2.1.1
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PVL-PSOCYP
1
.
114
4.2.1.2
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PFB-PSOCYPL
.
116
4.2.1.3
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PFB-PSOCYP2
.
116
4.2.1.4
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PFB-PSOCPR
.
116
4.2.2
TRANSFEKTIONEN
.
120
4.2.2.1
TRANSFEKTION
MIT
DEM
PLASMID
PVL-PSOCYPL
.
120
4.2.2.2
TRANSFEKTION
MIT
REKOMBINIERTEN
BACMIDEN
.
121
4.2.3
INFEKTIONEN
UND
KOINFEKTIONEN
.
123
4.2.4
NACHWEIS
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
ENZYME
.
124
4.2.4.1
AUFNAHME
VON
CO-DIFFERENZSPEKTREN
.
124
4.2.4.2
BESTIMMUNG
DER
CYTOCHROM
P450-REDUKTASE
.126
4.2.4.3
ENZYMTESTS
.
127
V.
DISKUSSION
.
128
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
.
148
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
.
151 |
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