Identifizierung, Sequenzierung und Expression zweier ABC-Transporter-Operons von Thermoplasma acidophilum:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 1998 |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
1
1.1
AUFBAU
DER
ABC-TRANSPORTER
1
1.2
DIE
HYDROPHOBEN
DOMAENEN
DER
ABC-TRANSPORTER
2
1.3
DIE
HYDROPHILEN
DOMAENEN
DER
ABC-TRANSPORTER
3
1.4
BINDEPROTEINE
DER
ABC-TRANSPORTER
6
1.5
VORKOMMEN
DER
ABC-TRANSPORTER
UND
IHRE
BEDEUTUNG
7
1.6
ZIELSTELLUNG
DER
ARBEIT
8
2
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
BAKTERIENSTAEMME
9
2.2
PLASMIDE
9
2.3
ENZYME
9
2.4
STANDARDS
UND
ANTIKOERPER
10
2.5
CHEMIKALIEN
UND
ANDERE
MATERIALIEN
10
2.6
OLIGONUKLEOTIDE
11
2.7
ANZUCHTBEDINGUNGEN
UND
MEDIEN
12
2.7.1
ANZUCHT
VON
THERMOPLASMA
ACIDOPHILUM
12
2.7.2
ANZUCHT
VON
E.
COLI
12
2.8
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
13
2.8.1
ISOLATION
CHROMOSOMALER
DNA
13
2.8.2
PLASMIDISOLIERUNG
14
2.8.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER
DNA
14
2.8.4
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
DNA
14
2.8.5
ZYKLISIERUNG
DER
DNA-RESTRIKTIONSFRAGMENTE
15
2.8.6
LIGATION
15
2.8.7
TRANSFORMATION
15
2.8.8
HERSTELLUNG
VON
ELEKTROKOMPOTENTEN
ZELLEN
15
2.8.9
KOLONIE-SCREENING
16
2.8.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
16
2.8.11
REINIGUNG
DER
PCR-PRODUKTE
18
2.8.12
DNA-SEQUENZIERUNG
18
2.8.13
SEQUENZANALYSE
18
2.8.14
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
18
2.9
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
19
2.9.1
ISOLIERUNG
VON
ZYTOPLASMAMAMBRANEN
AUS
T.
ACIDOPHILUM
19
2.9.2
PROTEINBESTIMMUNG
19
2.9.3
AUFKONZENTRIERUNG
VON
PROTEINPROBEN
20
2.9.4
AMINOSAEURESEQUENZIERUNG
20
2.9.5
SDS-PAGE
20
2.9.6
PROTEINFAERBUNG
21
2.9.6.1
COOMASSIE-FAERBUNG
21
2.9.6.2
SILBERFAERBUNG
21
2.9.7
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
BLUE
SEPHAROSE
CL-6B
22
2.9.8
METHODEN
ZUR
REKOMBINANTEN
PROTEINEXPRESSION
22
2.9.8.1
SCHNELLTEST
ZUR
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
22
2.9.8.2
ISOLIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
23
2.9.8.3
PROTEINREINIGUNG
DURCH
NI
2+
-NTA
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
23
2.9.8.4
PROTEINBINDUNG
AN
ATP-AGAROSE
24
2.9.8.5
RUECKFALTUNG
DENATURIERTER
PROTEINE
24
2.10
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
25
2.10.1
PROTEINTRANSFER
AUF
NITROZELLULOSE
25
2.10.2
WESTEM-BLOT
26
3
ERGEBNISSE
27
3.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
ABC-TRANSPORTERN
27
3.1.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
ABC-TRANSPORTERN
MIT
HILFE
VON
ANTIBIOTIKA-RESISTENTEN
MUTANTEN
27
3.1.1.1
GEWINNUNG
VON
ANTIBIOTIKA-RESISTENTEN
MUTANTEN
27
3.1.1.2
VERGLEICH
DER
MEMBRANPROTEINE
VON
WILDTYP
UND
MUTANTE
30
3.1.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
ABC-TRANSPORTERGENEN
MITTELS
PCR-METHODE
30
3.1.2.1
PRIMERDESIGN
31
3.1.2.2
ISOLIERUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
GENE
32
3.1.3
SEQUENZIERUNG
DER
OPERONS
A
UND
B
34
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
OPERONS
A
35
3.2.1
EIGENSCHAFTEN
DER
NUKLEOTIDSEQUENZEN
35
3.2.2
CODON-NUTZUNG
40
3.3
ANALYSE
DER
AUS
DEM
OPERON
A
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZEN
42
3.3.1
DIE
HYDROPHOBEN
PROTEINE
ORFA1
UND
ORFA2
43
3.3.1.1
SEQUENZVERGLEICHE
44
3.3.2
DIE
HYDROPHILEN
PROTEINE
ORFA3
UND
ORFA4
49
3.3.2.1
SEQUENZVERGLEICHE
50
3.4
GENEXPRESSION
59
3.4.1
EXPRESSIONSVEKTOR
59
3.4.2
ANREICHERUNG
DER
ABC-TRANSPORTERGENE
FUER
DIE
EXPRESSION
59
3.4.3
ERSTELLUNG
VON
EXPRESSIONSKONSTRUKTEN
61
3.4.4
EXPRESSION
DES
ATP-BINDENDEN
PROTEINS
ORFA3
61
3.4.5
EXPRESSION
DES
ATP-BINDENDEN
PROTEINS
ORFA4
64
3.4.6
EXPRESSION
VON
MEMBRANPROTEINEN
65
3.4.6.1
EXPRESSION
VON
MEMBRANPROTEINEN
ORFA1
UND
ORFA2
66
3.4.6.2
COEXPRESSION
67
4
DISKUSSION
70
4.1
VORKOMMEN
VON
ABC-TRANSPORTEM
IN
ARCHAEA
70
4.2
DAS
OPERON
70
4.2.1
STRUKTUR
DER
ABC-TRANSPORTER-OPERONS
A
UND
B
70
4.2.2
FUNKTION
DES
ABC-TRANSPORTERS
A
72
4.2.3
SIND
DIE
TRANSPORTER
A
UND
B
BINDEPROTEIN-UNABHAENGIG?
76
4.3
DIE
EXPRESSION
77
4.3.1
EXPRESSION
DER
ATP-BINDENDEN
PROTEINE
77
4.3.2
EXPRESSION
DER
MEMBRANPROTEINE
79
4.4
AUSBLICK
79
5
ZUSAMMENFASSUNG
81
6
LITERATURVERZEICHNIS
83
7
ABKUERZUNGEN
98 |
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