Untersuchung der Bedeutung des löslichen Interzellulären Adhäsionsmoleküls (ICAM)-1 bei der Pathogenese des Typ-1-Diabetes:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
DER
TYP-1
DIABETES
.
1
1.1.1.
POLYGENETISCHE
PRAEDISPOSITION
DES
TYP
1
DIABETES
.
1
1.1.2.
TYP
1
DIABETES
ALS
AUTOIMMUNERKRANKUNG
.
2
1.1.3.
INFILTRATION
VON
IMMUNZELLEN
IN
DIE
LANGERHANS'SCHEN
INSELN
DES
PANKREAS
(INSULITIS)
.
3
1.1.4.
KLINISCHE MANIFESTATION
DES
INSULINMANGELS
UND
REMISSIONSPHASE
.
4
1.2.
TIERMODELLE
ZUM
TYP-1
DIABETES
.
4
1.2.1.
DIE
NOD
(YYNON
OBESE
DIABETIC
"
)
-
MAUS
.
5
1.2.2.
CYCLOPHOSPHAMID-BESCHLEUNIGTER DIABETES
BEI
DER
NOD-MAUS
.
6
13.
ADHAESIONSMOLEKUELE
UND
DAS
INTERZELLULAERE
ADHAESIONSMOLEKUEL (ICAM)-1
.
6
1.3.1.
MOLEKULARE
UND
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
ICAM
1
.
7
1.3.2.
EXPRESSION
UND
BINDUNGSPARTNER
VON
ICAM-1
.
8
1.3.3.
IMMUNOLOGISCHE
BEDEUTUNG
VON
ICAM-1
.
8
1.3.4.
DAS
LOESLICHE,
IM
SERUM
ZIRKULIERENDE
ICAM-1
(CICAM-1)
.
10
1.3.5
ICAM-1-DEFIZIENTE
(ICAM-1
K.O.)
TIERE
.
10
1.4.
HINWEISE
ZUR
BEDEUTUNG
VON
ICAM-1
BEI
DER
PATHOGENESE
DESTYP-1
DIABETES
.
11
13.
DIE
AUFGABENSTELLUNG
.
12
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1.
MATERIALIEN
.
13
2.1.1.
GERAETE
.
13
2.1.2.
KLEINMATERIALIEN
.
13
2.1.3.
TIERE
(MIT
GENOTYPEN)
.
14
2.1.4.
ZELLINIEN
.
14
2.1.5.
ENZYME
.
14
2.1.6.
FERTIGMEDIEN
UND
MEDIENBESTANDTEILE
.
15
2.1.7.
CHEMIKALIEN
.
15
2.1.8.
FAERB
UND
FAERBELOESUNGEN
.
17
2.1.9.
FERTIGLOESUNGEN/FERTIGREAGENZIEN
.
17
2.1.10.
PLASMIDE
UND
REKOMBINANTE
VIREN
(BACULOVIRUS)
.
17
2.1.11.
OLIGONUKLEOTIDPRIMER
.
17
2.1.12.
MEDIEN
(ZUSAMMENSETZUNGEN)
.
18
2.1.13.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
.
20
2.1.13.1.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
ZUR
DNA-ISOLIERUNG
.
20
2.1.13.2.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
ZUR
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
21
2.1.13.3.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
ZUR
SILBER-FAERBUNG
.
21
2.1.13.4.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
ZUM
TRANSFER
UND
ZUR
IMMUNDETEKTION
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
(YYECL-WESTEMBLOT
"
)
.
22
2.1.13.5.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
ELISA
(YYENZYME
LINKED
IMMUNO
ADSORBENT
ASSAY
"
)
.
22
2.1.13.6.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
SAEULEN
.
22
2.1.13.7.
WEITERE
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
.
23
2.1.14.
ANTIKOERPER
.
23
2.1.15.
SEREN
AUS
DER
CYCLOSPORIN-A-STUDIE
.
24
2.1.16.
EINWEGARTIKEL
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
24
2.1.17.
STERILISATION
VON
CHEMIKALIEN
UND
GERAETEN
.
24
2.2.
METHODEN
.
25
2.2.1.
DNA-AUFREINIGUNG
.
25
2.2.1.1.
METHODE
ZUR
ANALYTISCHEN
PLASMID-DNA-ISOLIERUNG
.
25
2.2.1.2.
METHODE
ZUR
PRAEPARATIVEN
PLASMID-DNA-ISOLIERUNG
.
25
2.2.1.3.
DNA-ISOLIERUNG
ZUM
NACHWEIS
DER
ICAM-1
DEFIZIENZ
UND
DIABETES-SUSZEPTIBLER
GENE
IN
DER
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
26
2.2.2.
HORIZONTALE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
26
2.2.3.
RESTRIKTION
VON
PLASMID-DNA
.
26
2.2.4.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ESCHERICHIA
COLI
TOPIOF
ZELLEN
.
26
2.2.5.
LIGATION
VON
DNA
.
27
2.2.6.
TRANSFORMATION
.
27
2.2.7.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
27
2.2.8.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
MURINEM
UND
HUMANEM
ICAM-1
IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
29
2.2.8.1
.
TRANSFEKTION
UND
DETEKTION
REKOMBINANTER
KLONE
.
29
2.2.8.2.
AUFREINIGUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
REKOMBINANTER
VIREN
IM
YYPLAQUE-ASSAY
"
.
30
2.2.8.3.
REKLONIERUNG
UND
ERHOEHUNG
DER
VIRUSKONZENTRATION
IM
,JNCREASING-ASSAY
"
.
30
2.2.8.4.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
IM
,JNFEKTIONS-ASSAY
"
.
30
2.2.9.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
31
2.2.10.
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
REKOMBINANTER
ICAM
1
-PROTEINE
.
31
2.2.11.
ICAM
1
-ELISAS (YYENZYME
LINKED
IMMUNO
ADSORBENT
ASSAYS
"
)
.
32
2.2.12.
VERTIKALE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE,
10%)
ZUR
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
.
33
2.2.
1
3.
SILBER-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IM
POLYACRYLAMIDGEL
NACH
PAGE
.
33
2.2.14.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
(YYWESTEMBLOT
"
)
.
33
2.2.15.
IMMUNDETEKTION
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN,
ECL
(YYENHANCED
CHEMILUMINESCENCE
"
)-METHODE
.
34
2.2.16.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
REKOMBINANTEM
HUMANEM
ICAM-1
.
35
2.2.17.
AUFARBEITUNG
VON
GESAMTBLUT-ZELLEN
ZUR
FACS
(YYFLUORESZENZ
AKTIVIERTER
ZELLSORTER
"
)-ANALYSE
.
35
2.2.18.
ICAM
1
-NACHWEIS
DURCH
FACS
.
36
2.2.19.
FRAKTIONIERTE
FPLC
(YYFAST
LIQUID
PROTEIN
CHROMATOGRAPHY
"
)
ZUR
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
VON
LOELICHEM
ICAM-1
(CICAM-1)
IM
MAUSSERUM
.
36
2.2.20.
AUFREINIGUNG
VON
GESAMT-MILZZELLEN
UND
EXPRESSION
VON
LOESLICHEM
ICAM-1
.
37
2.2.21.
BESTIMMUNG
DER
LEUKOZYTENZAHL
.
37
2.2.22.
BESTIMMUNG
VON
DIFFERENTIALBLUTBILDEM
.
37
2.2.23.
BESTIMMUNG
DER
BLUTGLUKOSE
.
37
2.2.24.
INTERVENTIONSSTUDIE
MIT
ANTI-LCAM-1
UND
ANTI-LFA-1
IM
TIERMODELL
DES
DURCH
CYCLOPHOSPHAMID BESCHLEUNIGTEN
DIABETES
DER
NOD-MAUS
.
38
2.2.25.
INTERVENTIONSSTUDIE
MIT
REKOMBINANTEN
LOESLICHEN
ICAM-1-PROTEINEN
IM
TIERMODELL
DER
SPONTAN
DIABETISCHEN
NOD-MAUS
.
38
2.2.26.
KINETISCHE
ANALYSEN
VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
.
39
2.2.27.
EINKREUZEN
DES
ICAM-1-DEFEKTGENS
IN
NOD-MAEUSE
.
39
2.2.28.
HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG
VON
HISTOLOGISCHEN
PRAEPARATEN
.
40
2.2.29.
HISTOLOGISCHE
ANALYSEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
INFILTRATIONSSTADIEN
DER
LANGERHANS'SEHEN
INSELN
DES
PANKREAS
.
40
2.2.30.
UNTERSUCHUNG
DER
SEREN
VON
PROBANDEN
DER
STUDIE
DER
YYCANADIAN-EUROPEAN
RANDOMIZED
CONTROL
TRIAL
GROUP
"
AUF
IHREN
GEHALT
AN
LOESLICHEM
ICAM-1
(CICAM-1)
.
40
2.2.31.
STATISTISCHE
ANALYSEN
.
41
II
3.
ERGEBNISSE
.
42
3.1.
BESTIMMUNG
INDIVIDUELLER,
LOESLICHER
ICAM-1
(CICAM-L)-SERUMSPIEGEL
NACH
MANIFESTATION
DES
IDDM,
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
CYCLOSPORIN-A-THERAPIE
UND
VON
DER
REMISSIONSPHASE
.
42
3.1.1.
INDIVIDUELLE
CICAM
1
-SERUMSPIEGEL
.
42
3.1.2.
MITTLERE
CICAM
1
-SERUMSPIEGEL
UND
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
CYCLOSPORIN-A-THERAPIE
.
43
3.1.3.
MITTLERE
CICAM
1
-SERUMSPIEGEL
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
REMISSIONSPHASE
.
45
3.1.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
46
3.2.
INTERVENTIONSSTUDIE
MIT
ANTI-ICAM-1
UND
ANTI-LFA-1
IM
TIERMODELL
DES
DURCH
CYCLOPHOSPHAMID
BESCHLEUNIGTEN
DIABETES
DER
NOD-MAUS
.
47
3.2.1.
VERTRAEGLICHKEIT
DER
INTERVENTIONEN
.
47
3.2.2.
DIABETESMANIFESTATION
UND
INZIDENZ
.
47
3.2.3.
INSULITISGRADE
.
49
3.2.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
49
33.
NACHWEIS
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
ICAM-1
.
SO
3.3.1.
REKLONIERUNG,
MOLEKULARBIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
UND
NACHWEIS
DER
TRANSFEKTION
IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
50
3.3.2.
NACHWEIS
VON
REKOMBINANTEN
LOESLICHEN
ICAM-1-PROTEINE
DURCH
SILBER-FAERBUNG
UND
ELISA
.
51
3.3.3
NACHWEIS
VON
REKOMBINANTEN
LOESLICHEN
ICAM-1-PROTEINEN
DURCH
YYWESTEMBLOT
"
.
53
3.3.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
55
3.4.
INTRAVITALMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
WIRKUNG
VON
REKOMBINANTEM
ICAM-1
AUF
DAS
ADHAESIONSVERHALTEN
VON
LEUKOZYTEN
IM
ISCHAEMIE/REPERFUSIONSMODELL
DER
C57B1/6
MAUS
.
56
3.4.1.
BESTIMMUNG
DER
ANZAHL
YYROLLENDER
"
LEUKOZYTEN
.
57
3.4.2.
BESTIMMUNG
DER
ANZAHL
ADHAERENTER
LEUKOZYTEN
.
58
3.4.3.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
59
3.5.
WIRKUNG VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
AUF
BLUTZELLEN
(PBMC)
UND
INSEL-ANTIGEN-SPEZIFISCHE
T-ZELL-KLONE
VON
FRISCH
MANIFESTIERTEN
TYP-1
DIABETIKERN
.
60
3.5.1.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
HUMANEM
ICAM-1
.
60
3.5.2.
WIRKUNG
VON
REKOMBINANTEM
MOMEREM
ICAM-1
(HICL-5D)
.
62
3.5.3.
WIRKUNG
VON
ICAM-L-KONJUGATEN
(ICL-2D/IGA
UND
ICL-2D/IGM)
.
63
3.5.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
64
3.6.
UNTERSUCHUNG
DER
PATHOPHYSIOLOGISCHEN
WIRKUNG
VON
REKOMBINANTEM
ICAM-1
IM
TIERMODELL
DER
NOD-MAUS
.
65
3.6.1.
VERTRAEGLICHKEIT
DER
INTERVENTIONEN
.
65
3.6.2.
DIABETESMANIFESTATION
UND
INZIDENZ
.
65
3.6.2.1.
KONTROLLGRUPPE
.
66
3.6.2.2.
WIRKUNG
VON
MURINEM
MONOMEREM
ICAM-1
(MICL-5D)
AUF
DIE
DIABETESMANIFESTATION
UND
INZIDENZ
.
67
3.OE.2.3.
WIRKUNG
VON
MURINEM
DIMEREM
ICAM-1
(MICL-2D/IGG)
AUF
DIE
DIABETESMANIFESTATION
UND
INZIDENZ
.
67
3.OE.2.4.
WIRKUNG
VON
HUMANEM
MONOMEREM
ICAM-1
(HICL-5D)
AUF
DIE
DIABETESMANIFESTATION
UND
INZIDENZ
.
67
3.6.3.
INSULITISGRADE
.
68
3.6.4.
WIRKUNG
DER
INTERVENTIONEN
AUF
DIE
CICAM
1
-SERUMSPIEGEL
.
69
3.6.5.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
71
3.7.
UNTERSUCHUNG
DER
BEDEUTUNG
VON
ICAM-1
BEI
DER
ENTWICKLUNG
DES
TYP-1
DIABETES
DURCH
EINKREUZEN
DES
ICAM-L-DEFEKTGENS
IN
NOD-MAEUSE
.
73
3.7.1.
NACHWEIS
DERLCAM-L-DEFIZIENZ
.
74
III
3.7.2.
NACHWEIS
DIABETES-SUSZEPTIBLER
GENE
.
76
3.7.3.
DIABETESMANIFESTATION
UND
INZIDENZ
.
77
3.7.4.
INSULITIS
.
78
3.7.5.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
80
3.8.
NACHWEIS
VON
LOESLICHEM
ICAM-1
(CICAM-1)
BEI
ICAM-L-DEFIZIENTEN
MAEUSEN
.
81
3.8.1.
NACHWEIS
DURCH
ANTI-MURIN-ICAM
1
-SPEZIFISCHE
ELISAS
.
81
3.8.2.
NACHWEIS
DER
FREISETZUNG
DURCH
GESAMT-MILZZELLEN
.
82
3.8.3.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
DURCH
FPLC
.
83
3.8.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
.
84
4.
DISKUSSION
.
85
4.1.
DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG
VON
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
PATHOGENESE
DES
TYP-1
DIABETES
.
85
4.2.
PATHOPHYSIOLOGISCHE
WIRKUNG
DES
REKOMBINANTEN
LOESLICHEN
ICAM-1
UND
DIE
BEDEUTUNG
VON
ICAM-1
BEIM
TYP-1
DIABETES
.
87
4.2.1.
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
ICAM
1
.
88
4.2.2.
PATHOPHYSIOLOGISCHE
WIRKUNG
VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
ENDOTHELIALEN
ADHAESION
VON
LEUKOZYTEN
IN
EINEM
ISCHAEMIE/REPERFUSIONSMODELL
.
89
4.2.3.
WIRKUNG
VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
INSEL-ANTIGEN-SPEZIFISCHEN
T-ZELL
PROLIFERATION
.
91
4.2.4.
PATHOPHYSIOLOGISCHE
WIRKUNG
VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
IM
NOD-TIERMODELL
.
93
4.2.5.
BEDEUTUNG
DER
ICAM
1
-DEFIZIENZ
BEI
DER
PATHOGENESE
DES
TYP
1
DIABETES
IM
NOD-TIERMODELL
UND
DER
NACHWEIS
VON
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
ICAM-1-DEFEKTMAUS
.
95
4.2.6.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
PATHOPHYSIOLOGISCHEN
BEDEUTUNG
VON
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
PATHOGENESE
DES
TYP-1
DIABETES
.
99
4.3.
DIE
THERAPEUTISCHE
BEDEUTUNG
VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
PATHOGENESE
DES
TYP-1
DIABETES
.
100
4.3.1.
THERAPEUTISCHE
BEDEUTUNG
DER
INHIBITION
DER
ICAM
1
-ABHAENGIGEN
ZELLULAEREN
WECHSELWIRKUNGEN
.
100
4.3.2.
BEEINFLUSSUNG
PHYSIOLOGISCHER
CICAM
1
-SERUMSPIEGEL
DURCH
THERAPIE
MIT
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
MONOMEREM
ICAM-1
(MICL-5D)
.
101
4.3.3.
THERAPEUTISCHE
BEDEUTUNG
VON
REKOMBINANTEM
MULTIMERISIERTEM
ICAM-1
.
102
4.3.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
THERAPEUTISCHEN
BEDEUTUNG
VON
REKOMBINANTEM
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
PATHOGENESE
DES
TYP-1
DIABETES
.
103
5.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
BEDEUTUNG
VON
LOESLICHEM
ICAM-1
BEI
DER
PATHOGENESE
DES
TYP-1
DIABETES
.
104
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
106
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
120
8.
MEDIZINISCHES
GLOSSAR
.
123
IV |
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