Isolierung und Charakterisierung von Trockenstreß-induzierten Genen mit potentiell regulatorischer Funktion aus der Wiederauferstehungspflanze Craterostigma plantagineum:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VII, 172 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
VI
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
BIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DES
WASSERS
1
1.2.
TROCKENSTREFI
2
13.
STRATEGIEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
TROCKENTOLERANZ
4
1.4.
TROCKENINDUZIERTE
GENE
8
L.S.
MOEGLICHE
FUNKTION
TROCKENINDUZIERTER
GENE
10
1.6.
CRATEROSTIGMA
PLANTAGINEUM
16
1.7.
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
WAEHREND
DER
AUSTROCKNUNG
19
1.8.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
23
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
26
2.1.
MATERIAL
26
2.1.1.
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
KITS,
RADIOISOTOPE
UND
NAEHRMEDIEN
26
2.1.2.
E.
COLI
BAKTERIENSTAEMME
26
2.1.3.
VEKTOREN
27
2.1.4.
MEDIEN
27
2.1.5.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
27
2.1.6.
PFLANZENMATERIAL
29
2.2.
METHODEN
29
2.2.1.
PHYSIOLOGISCHE
METHODEN
29
2.2.1.1.
ERNTE
UND
LAGERUNG
VON
C.
PLANTAGINEUM
29
2.2.1.2.
AUSTROCKNUNG
VON
C.
PLANTAGINEUM
30
2.2.1.3.
WIEDERBEWAESSERUNG
GETROCKNETER
PFLANZEN
31
2.2.1.4.
AB
A-BEHANDLUNG
VON
C.
PLANTAGINEUM
31
2.2.2.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
32
INHALTSVERZEICHNIS[I
2.2.2.1.
ISOLIERUNG
VON
GESAMTPROTEIN
AUS
C.
PLANTAGINEUM
32
2.2.2.2.
ISOLIERUNG
VON
KEMPROTEINEN
AUS
C.
PLANTAGINEUM
32
2.2.2.3.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
33
2.2.2.4.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
33
2.2.2.4.I.
PROBENVORBEREITUNG
33
2.2.2.4
2.
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
DENATURIERENDE
SDS-POLYACRYLAMIDGEL
ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
33
2.2.2.4.3.
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
34
2.2.2.5.
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
34
2.2.2.6.
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
(SEMIDRY-BLOTTING)
34
2.2.2.7.
IMMUNODETEKTION
VON
PROTEINEN
35
2.2.2.8.
FLUOROGRAPHIE.
DETEKTION
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROTEINE
35
2.2.3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
36
2.2.3.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
36
2.2
3.1.1.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
C.
PLANTAGINEUM
36
2.2.3.1.2.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
C.
PLANTAGINEUM
36
2.2.3.1.3.
ISOLIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
AUS
C.
PLANTAGINEUM
37
2.2.3.1.4.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
38
2.2.3.1.5.
ISOLIERUNG
VON
DNA
DES
BAKTERIOPHAGEN
X
38
2.2.3.2.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
38
2.2.3.2.I.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
RNA
IN
NATIVEN
AGAROSEGELEN
38
2.2.3.2.2.
SOUTHERN
BLOT
39
2.2.3.2.3.
NORTHERN
BLOT
39
2.2.3.2.4.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
40
2.2.3.2.5.
EMSA
-
ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY:
AUFTRENNUNG
VON
DNA
PROTEIN-KOMPLEXEN
IN
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
40
2.2.3.2.6.
AUFTRENNUNG
EINZELSTRAENGIGER
DNA
IN
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
42
2.2.3.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
NACH
DER
GELELEKTROPHORESE
42
2.2.3.3.I.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
NATIVEN
AGAROSEGELEN
42
2.2.3.3.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
(ELEKTROELUTION)
42
2.2.3.3.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
(DIFFUSION)
43
2.2.3.4.
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
43
2.2.3.4.1.
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
RADIOISOTOPEN
MITTELS
RANDOM-PRIMER-LABELING
43
2.2.3.4.2.
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
RADIOISOTOPEN
UND
BIOTINYLIERTEN
NUKLEOTIDEN
DURCH
AUFFULLEN
KOHAESIVER
ENDEN
44
2.2.3.4.3.
MARKIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
MIT
RADIOISOTOPEN
44
2.2.3.5.
DNA-MODIFIZIERENDE
REAKTIONEN
44
2.2.3.6.
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
PCR
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION)
45
2.2.3.7.
DIFFERENTIAL
DISPLAY
REVERSE
TRANSCRIPTASE-PCR
(DDRT-PCR)
45
2.2.3.8.
HERSTELLEN
EINER
CDNA-EXPRESSIONSBANK
49
2.2.3.9.
SCREENING
EINER
CDNA-EXPRESSIONSBANK
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
(SOUTH
WESTEM
SCREENING)
49
2.2.3.10.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
50
2.2.3.11.
IN
VITRO
TRANSLATION
51
INHALTSVERZEICHNIS
_
M
2.2.3.12.
IMMUNOPRAEZIPITATION
51
2.2.3.13.
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
52
2.2.3.14.
DNA-SEQUENZIERUNG
UND
SEQUENZDATENANALYSEN
52
2.2.3.15.
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
EINES
REKOMBINANTEN
THIOREDOXIN
FUSIONSPROTEINS
IN
E.
COLI
53
2.2.3.16.
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
53
2.2.3.17.
BAKTERIENKULTUR:
FLUESSIGKULTUR,
LAGERUNG
UND
KRYOKONSERVIERUNG
53
2.2.3.18.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.
CO/I-ZELLEN
54
2.2.3.19.
SCREENING
EINER
LAMBDA-CDNA-BANK
(PLAQUEHYBRIDISIERUNG)
54
2.2
3.20.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
55
2.2.3.21.
VERWENDETE
PRIMER
55
3.
ERGEBNISSE
56
3.1.
SOUTH
WESTERN
SCREENING
EINER
CDNA-EXPRESSIONSBANK
56
3.1.1.
HERSTELLUNG
VON
MULTIMEREN
DER
CDET
27-45
PROMOTORBINDUNGSSTELLE
56
3.1.2.
UEBERPRUEFEN
DES
PENTAMERS
UND
DECAMERS
MITTELS
EMSA
57
3.1.3.
SOUTH
WESTERN
SCREENING
EINER
CDNA-EXPRESSIONSBANK
AUS
ID
ABA
BEHANDELTEM
KALLUS
57
3.2.
BIOCHEMISCHE
AUFREINIGUNG
DER
TRANS-AKTIVIERENDEN
FAKTOREN
DES
CDET
27-45
PROMOTORS
59
3.2.1.
UEBERPRUEFEN
DER
STABILITAET
DES
DNA-PROTEIN-KOMPLEXES
IN
ABHAENGIGKEIT
DER
SALZKONZENTRATION
60
3.2.2.
HEPARIN
AGAROSE-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
61
3.2.3.
ANREICHERUNG
DER
TRANS-AKTIVIERENDEN
FAKTOREN
UEBER
EINE
FPLC
MONO
S
HR5/5
SAEULE
62
3.2.4.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
DEN
AKTIVEN
FPLC-FRAKTIONEN
64
3.3.
DDRT-PCR
ZUR
ISOLIERUNG
REGULATORISCHER
GENE
67
3.3.1.
UEBERPRUEFEN
DER
POLY(A)
+
-RNA
AUF
VERUNREINIGUNG
MIT
GENOMISCHER
DNA
70
3.3.2.
DDRT-PCR
MIT
POLY(A)*-RNA
AUS
2
H
GETROCKNETEN,
4
H
ABA-BEHANDELTEN
UND
FRISCHEN
BLAETTERN
71
3.4.
CHARAKTERISIERUNG
DES
KLONS
PLD-1
(PHOSPHOLIPASE
D)
78
3.4.1.
EXPRESSIONSANALYSEN
DES
PLD
1
-TRANSKRIPTS
78
3.4.2.
SCREENING
NACH
EINEM
PLD-1
CDNA-KLON
VOLLER
LAENGE
UND
DESSEN
SEQUENZIERUNG
79
3.4.3.
GENOMISCHE
ORGANISATION
VON
PLD-1
IN
C.
PLANTAGINEUM
81
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.4.4.
HOMOLOGIEVERGLEICH
ZWISCHEN
DER
PHOSPHOLIPASE
D-SEQUENZ
AUS
C.
PLANTAGINEUM
UND
SEQUENZEN
VON
PHOSPHOLIPASE
D
AUS
ANDEREN
SPEZIES
82
3.5.
CHARAKTERISIERUNG
DES
KLONS
HDZIP-1
(HOMOEODOMAENE-LEUCIN-ZIPPER)
84
3.5.1.
EXPRESSIONSANALYSEN
DES
HDZIP-L-TRANSKRIPTS
84
3.5.2.
SCREENING
EINER
CDNA-BANK
NACH
EINEM
HDZIP-1
CDNA-KLON
VOLLER
LAENGE
UND
DESSEN
SEQUENZIERUNG
86
3.5.3.
GENOMISCHE
ORGANISATION
VON
HDZIP
1
IN
C.
PLANTAGINEUM
89
3.5.4.
HOMOLGIEVERGLEICH
ZWISCHEN
DER
SEQUENZ
VON
HDZIP-1
AUS
C.
PLANTAGINEUM
UND
SEQUENZEN
VON
HOMOEOBOXGENEN
AUS
ANDEREN
SPEZIES
90
3.6.
EXPRESSION
EINES
THIOREDOXIN-HDZIP-L-FUSIONSPROTEINS
IN
COLI
92
3.6.1.
KLONIERUNG
DER
HDZIP
1
CDNA
IN
DEN
VEKTOR
PTRXFUS
93
3.6.2.
ANALYSE
DER
INDUKTION
UND
DES
LOESLICHKEITSVERHALTENS
DES
FUSIONSPROTEINS
94
3.6.3.
AUFREINIGUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
MITTELS
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
96
3.7.
IMMUNODETEKTION
DES
HDZIP-L-PROTEINS
MIT
EINEM
POLYKLONALEN
ANTISERUM
97
3.7.1.
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
HDZIP-1
ANTISERUMS
MITTELS
IMMUNO
PRAEZIPITATION
97
3.7.2.
WESTERN
BLOT
MIT
HDZIP-1
ANTISERUM
UND
GESAMT-PROTEINEXTRAKTEN
AUS
C.
PLANTAGINEUM
100
3.8.
IN
VITRO
BINDUNGSSTUDIEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
POTENTIELLER
DNA-
ERKENNUNGSSEQUENZEN
DES
HDZIP-L-PROTEINS
DURCH
CASTING
(CYCLIC
AMPLIFICATION
AND
SELECTION
OF
TARGETS)
103
3.8.1.
CASTING-EXPERIMENT
106
3.8.2.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
SELEKTIERTEN
ZIEL-DNA
112
3.8.3.
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
MOTIV
1,
MOTIV
2,
MOTIV
3
UND
MUTIERTEM
MOTIV
1
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
ANSTEIGENDEN
MENGEN
SPEZIFISCHEN
KOMPETITORS
112
4.
DISKUSSION
120
4.1.
DIE
DNA-BINDUNG
DES
CDET
27-45
PROMOTORS
DURCH
KERNPROTEINE
IST
KOMPLEX
120
4.2. DIE
MULTIMERISIERTE
KERNBINDUNGSSTELLE
DES
CDET
27-45
PROMOTORS
INTERAGIERT
MIT
KERNPROTEINEN
AUS
BLAETTERN
121
INHALTSVERZEICHNIS
V
43.
ENTWICKLUNG
EINES
SCHEMAS
ZUR
AUFREINIGUNG
DER
TRANS-AKTIVIERENDEN
FAKTOREN
DES
CDET
27-45
PROMOTORS
122
4.4.
SEQUENZANALYSEN
DER
MITTELS
DDRT-PCR
ISOLIERTEN
CDNAS
125
4.5.
PLD-1:
EIN
MITGLIED
DER
SIGNAL-AKTIVIERTEN
PHOSPHOLIPASEN
(SAPS)
126
4.6.
HDZIP-1:
EIN
MITGLIED
DER
HOMOEODOMAENE-LEUCIN-ZIPPER
PROTEIN
FAMILIE
130
4.7.
HDZIP-1
BINDET
AN
DREI
VERSCHIEDENE
DNA-MOTIVE
135
4.8.
AUSBLICK
136
5.
ZUSAMMENFASSUNG
140
6.
LITERATURVERZEICHNIS
142
DANKSAGUNG
170
ERKLAERUNG
171
LEBENSLAUF
172 |
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| author | Frank, Wolfgang |
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