Charakterisierung der positiven Cofaktoren 2 und 4 der RNA-Polymerase II:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Utz, Wiss.
1998
|
| Schriftenreihe: | Biochemie
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1997 |
| Beschreibung: | 133 S. Ill. |
| ISBN: | 3896752855 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG.
1
1.1.
PROMOTOREN
UND
DEREN
GENETISCHE
KONTROLLELEMENTE
.
1
1.2.
KONTROLLE
DER
TRANSKRIPTION
DURCH
AKTIVATOREN
.
2
1.3.
KONTROLLE
DER
TRANSKRIPTION
DURCH
REPRESSOREN
.
3
1.4.
DER
TRANSKRIPTIONSPROZEO
IN
EUKARYONTEN
AEHNELT
DEM
DER
PROKARYONTEN
.
.5
1.5.
EUKARYONTISCHE
RNA-POLYMERASEN
.
5
1.6.
GENERELLE
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
UND
PRAEINITIATIONSKOMPLEXBILDUNG
.
6
1.7.
DAS
TATA-BINDENDE
PROTEIN
(TBP)
UND
SEINE
ASSOZIIERTEN
FAKTOREN
.
7
1.8.
COFAKTOREN
DER
AKTIVIERTEN
TRANSKRIPTION
.
9
1.9.
AUFGABENSTELLUNG
.
10
2.
MATERIAL.
.
11
2.1.
GERAETE
.
11
2.2.
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
.
12
2.3.
RADIOCHEMIKALIEN
.
14
2.4.
ENZYME
.
14
2.5.
ANTIKOERPER
.
15
2.6.
LOESUNGEN,
PUFFER
UND
KULTURMEDIEN
.
16
2.6.1.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
16
2.6.2.
KULTURMEDIEN
.
16
2.7.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
HILFSMITTEL
.
17
2.8.
BAKTERIENSTAEMME
.
17
2.9.
DNA
UND
PROTEIN-GROESSENSTANDARDS
.
18
2.9.1.
DNA-GROESSENSTANDARDS
.
18
2.9.2.
PROTEIN-GROESSENSTANDARDS
.
18
2.10.
PLASMIDE
.
19
2.11.
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDE
.
.
20
3.
METHODEN
.
.22
3.1.
PROKARYONTISCHE
ZELLKULTUR
.
22
3.1.1.
ANZUCHT
VON
BAKTERIENKULTUREN
.
22
3.1.2.
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
.
22
3.2.
EUKARYONTISCHE
ZELLKULTUR
.
22
3.2.1.
ZELLENVERMEHRUNG
IN
SUSPENSION
.
22
3.2.2.
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
.
23
3.3.
DNA
UND
RNA-ARBEITSTECHNIKEN
.
23
3.3.1.
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
EINER
NUKLEINSAEURE-PRAEPARATION
.
23
3.3.2.
CHLOROPANE-EXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
24
3.3.3.
REINIGUNG
VON
DNA
UEBER
GELFILTRATION
.
24
3.3.4.
REINIGUNG
VON
DNA
UEBER
DE52-SAEULEN
.
25
3.3.5.
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
25
3.3.6.
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MIT
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
26
3.3.7.
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
VON
DNA
.
27
3.3.8.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
28
3.3.9.
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
28
3.3.10.
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDE
.
29
3.3.11.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDEN
AM
5'-ENDE
.
30
3.3.12.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.30
3.3.13.
AUFFULLEN
VON
5
'-UEBERHAENGENDEN
DNA-ENDEN
.
31
3.3.14.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
MITTELS
"RANDOM-HEXAMER-PRIMING
"
.
31
3.3.15.
LIGATION
VON
DNA
.
32
3.3.16.
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
COLI
.
32
3.3.17.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
.
33
3.3.18.
KLONIERUNG
VON
PC4-DERIVATEN,
GAL94,
HSRB7
UND
HRPB33
.
33
3.3.19.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
34
3.3.19.1.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DEM
DIDEOXY-KETTENABRUCHVERFAHREN
.
34
3.3.19.2.
ANFERTIGUNG
EINES
SEQUENZGELS
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
GELELEKTROPHORESE
.
35
3.3.20.
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
RNA
.
35
3.3.21.
HERSTELLUNG
DER
HETERODUPLEX-DNAS
.
36
3.4.
PROTEIN-ARBEITSTECHNIKEN
.
37
3.4.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
37
3.4.2.
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
37
3.4.3.
FAERBEMETHODEN
FUER
PROTEINE
.
38
3.4.3.1.
COOMASSIE-FAERBUNG
.
38
3.4.3.2.
SILBERFAERBUNG
.
39
3.4.4.
HERSTELLUNG
VON
ZELLKEMEXTRAKTEN
AUS
HELA-ZELLEN
.
40
3.4.5.
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IN
E.
COLI.
42
3.4.6.
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
43
3.4.6.1.
PHOSPHOCELLULOSE-CHROMATOGRAPHIE
.
44
3.4.6.2.
DEAE-CELLULOSE
(DE52)-CHROMATOGRAPHIE
.
45
3.4.6.3.
SEPHAROSE-IONENAUSTAUSCHER
.
46
3.4.OE.4.
GELFILTRATION
.
46
3.4.6.5.
"REVERSED
PHASE"-CHROMATOGRAPHIE
.
46
3.4.6.6.
NI2+-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
47
3.4.6
7.
HEPARIN-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
.48
3.4.6
8.
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
PC2
.
48
3.4.6.9.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
PC4-DERIVATEN
.
49
3.4.6.10.
REINIGUNG
VON
PC4(22-127)
IM
GROSSEN
MASSSTAB
FUER
KRISTALLSTRUKTURSTUDIEN
.
50
3.5.
REINIGUNG
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
.50
3.6.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
TFIIB,
TBP,
TFIIECT,
TFIIESS,
GAL94
UND
GAL4-AH
.
51
3.7.
IMMUNOCHEMISCHE
ARBEITSTECHNIKEN
.
52
3.7.1.
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
IN
KANINCHEN
.
52
3.7.2.
WESTERN-BLOT
ANALYSE
.
52
3.7.3.
IMMUNODEPLETION
.
54
3.8.
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
.
54
3.8.1.
GELRETARDATIONSANALYSE
(EMSA)
.
54
3.8.2.
DNASE
I-FOOTPRINTING
ANALYSE
.
55
3.8.3.
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
IN
EINEM
REKONSTITUIERTEN
RNA-POLYMERASE
II-SYSTEM
.
56
3.9.
COMPUTERANALYSEN
.
58
4.
ERGEBNISSE
.
.59
4.1.
REINIGUNG
DER
GENERELLEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
UND
HERSTELLUNG
EINES
IN
VITRO
KLASSE
II-TRANSKRLPTIONSSYSTEMS
.
59
4.2.
EIN
NEUES
VERFAHREN
ZUR
EINFACHEN
ABTRENNUNG
DER
COFAKTOREN
VON
DEN
GENERELLEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
61
4.3.
IDENTIFIZIERUNG
EINES
NEUEN
COFAKTORS
DER
RNA-POLYMERASE
II
.
63
4.3.1.
REINIGUNG
UND
KLONIERUNG
VON
PC4
.
63
4.3.2.
CHARAKTERISIERUNG
VON
PC4
.
63
4.3.2.1.
PC4
IST
EVOLUTIONAER
KONSERVIERT
.
64
4.3.2.2.
HOMOLOGIE
ZU
ZELLULAEREN
UND
VIRALEN
PROTEINEN
.
65
4.3.2.3.
PC4
WIRD
UBIQUITAER
EXPRIMIERT
.67
4.3.3.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PC4
.
67
4.3.3.1.
DELETIONSANALYSE
VON
PC4
.
67
4.3.3.2.
DIE
AKTIVITAET
VON
PC4
WIRD
DURCH
PROTEINKINASEN
REGULIERT
.
69
4.3.3.3.
PC4
SPIELT
IN
GROBEN
SYSTEMEN
EINE
ROLLE
.
73
4.3.3.4.
PC4
INTERAGIERT
MIT
DEM
TFIID-TFIIA-PROMOTORKOMPLEX
.
73
4.3.3.5.
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
VON
PC4
KORRELIERT
MIT
SEINEN
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
.
76
4.3.3.6.
PC4
BINDET
ZUSAMMEN
MIT
TFIID
UND
TFIIA
AN
DEN
PROMOTOR
.
79
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.3.3.7
PC4
STIMULIERT
DIE
TRANSKRIPTION
WAEHREND
DER
DA-KOMPLEXBILDUNG
.
81
4.3.3.8.
DNASE
I-FOOTPRINTING
ANALYSE
.
87
4.3.4.
ROENTGENSTRUKTURANALYSE
VON
PC4-PROTEINKRISTALLEN
.
89
4.4.
DER
POSITIVE
COFAKTOR
2
(PC2)
.
91
4.4.1.
REINIGUNG
VON
PC2
DURCH
KONVENTIONELLE
CHROMATOGRAPHIE
.
91
4.4.2.
AFFINITAETSREINIGUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
PC2
DURCH
DIFFERENTIELLE
DEPLETION
.
91
4.4.3,
PC2
FUNKTIONIERT
IN
EINEM
SPAETEN
SCHRITT
DER
INITIATIONSKOMPLEXBILDUNG
.
96
4.4.4.
DIE
AKTIVITAET
VON
PC2
WIRD
NICHT
VON
CKII
BEEINFLUSST
.
100
4.5.
PC2
UND
PC4
WIRKEN
SYNERGISTISCH
.
101
5.
DISKUSSION
.
103
5.1.
DREI
VERSCHIEDENE
KLASSEN
VON
COFAKTOREN
.
103
5.2.
PC2
UND
PC4,
ZWEI
NEUE
COFAKTOREN
DER
RNA-POLYMERASE
II-TRANSKRIPTION
.
104
53.
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
VON
PC4
WIRD
DURCH
PHOSPORYLIERUNG
KONTROLLIERT
.
106
5.4.
VIELE
COFAKTOREN
SIND
ANTAGAGONISTEN
DER
REPRESSION
DURCH
CHROMATIN.
.
107
5.5.
BEDEUTUNG
DER
DNA-BINDUNG
FUER
DIE
COFAKTORFUNKTION
.
109
5.6.
FUNKTIONELLE
UND
STRUKTURELLE
HOMOLOGIEN
VON
PC4
ZU
DEN
IMMEDIATE
EARLY
TRANSKRIPTIONSREGULATOREN
VON
HERPESVIREN
.
112
5.7.
PC4
IST
EVOLUTIONAER
HOCHKONSERVIERT
.
113
5.8.
DIE
KRISTALLSTRUKTUR
DER
CARBOXYTERMINALEN
DOMAENE
VON
PC4
.
114
5.1.6.
DIE
BIOLOGISCHE
ROLLE
VON
PCS
.
115
5.10.
AUSBLICK
.
117
6.
ZUSAMMENFASSUNG.
118
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
120 |
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