Das atriale natriuretische Peptid als autokriner Regulator der induzierbaren NO-Synthase: Untersuchungen zum molekularen Wirkmechanismus
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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| adam_text | - 30(O DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER
CHEMIE UND PHARMAZIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN DAS
ATRIALE NATRIURETISCHEPEPTID ALS AUTOKRINER REGULATOR DER
INDUZIERBARENNO-SYNTHASE - UNTERSUCHUNGEN ZUM MOLEKULAREN
WIRKMECHANISMUS VON ALEXANDRA KATHRIN KIEMER AUS MUENCHEN 1997
INHALTSVERZEICHNIS SEITE A. EINLEITUNG L 1. UEBERSICHT UND FRAGESTELLUNG
1 2. DIE NATRIURETISCHEN PEPTTOE 3 2.1 DIEPEPTIDE 3 2.1.1
GESCHICHTLICHES 3 2.1.2 STRUKTUR DER NATRIURETISCHEN PEPTIDE 3 2.1.3
BIOSYNTHESE UND PROZESSIERUNG DER NATRIURETISCHEN PEPTIDE 4 2.2 DIE
REZEPTOREN 5 2.2.1 GESCHICHTLICHES S 2.2.2 STRUKTUR UND
LIGANDENSELEKTIVITAET S 2.2.3 SIGNALUEBERTRAGUNG 6 2.2.4 REGULATION DER
REZEPTOREN 7 2.3 VORKOMMEN UND WIRKUNGEN DER NATRIURETISCHEN PEPTDE 7
2.3.1 NATRIURETISCHE PEPTIDE IM HERZ- KREISLAUFSYSTEM 7 2.3.2
NATRIURETISCHE PEPTIDE IM IMMUNSYSTEM 8 3. DIE INDUZIERBARE NO-SYNTHASE
* 9 3.1 DIE DREI NO-SYNTHASEN 9 3.1.1 GESCHICHTLICHES 9 3.1.2 KLONIERUNG
VON DREI ISOENZYMEN 9 3.1.3 NO-SYNTHESE AUS L-ARGININ 11 3.2 PHYSIOLOGIE
VON STICKSTOFFMONOXID 12 3.2.1 CHEMIE 12 3.2.2 VERMITTLUNG
PHYSIOLOGISCHER WIRKUNGEN 13 3.3 NO IM IMMUNSYSTEM 14 3.3.1 NO ALS WAFFE
DER MAKROPHAGEN 14 3.3.2 PATHOPHYSIOLOGIE DER NO-SYNTHESE 15 3.4
REGULATION DER INOS 15 3.4.1 TRANSKRIPTIONELLE REGULATION UEBER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 15 3.4.2 POSTTRANSKRIPTIONELLE REGULATION 16
3.4.3 ENDOGENE INHIBITOREN 18 3.4.4 EXOGENE INHIBITOREN 18 3.4.5 MODELLE
ZUR UNTERSUCHUNG DER INOS-REGULATION 19 4. DIE CVCLOOXYGENASE ET 20 4.1
DIE PROSTAGLANDINSYNTHESE 20 4.1.1 DIE ENTDECKUNG ZWEIER CYCLOOXYGENASEN
20 4.1.2 PHYSIOLOGIE UND PATHOPHYSIOLOGIE DER PROSTAGLANDINE 21
INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 4.2 REGULATION DER COX II 4.2.1
INHIBITOREN DER COX II 4.2.2 INTERAKTIONEN ZWISCHEN INOS UND COX II B.
MATERIAL UND METHODEN 23 23 24 25 1. TIERE, EUKARYONTISCHE ZELLEN,
BAKTERIEN UND VEKTOREN 1.1 TIERE 1.1.1 VERWENDETE TIERE 1.1.2
ORGANENTNAHME 1.2 ZELLKULTUR 1.2.1 NAEHRMEDIEN UND ZUSAETZE 1.2.2 LOESUNGEN
1.2.3 KULTIVIERUNG 1.2.4 MAKROPHAGEN-PRIMAERKULTUREN 1.2.5 EUKARYONTISCHE
ZELLINIEN 1.3 BAKTERIEN 1.3.1 EINGESETZTER STAMM 1.3.2 NAEHRMEDIEN UND
ANTIBIOTIKA 1.3.3 KULTIVIERUNG 1.4 VEKTOREN 1.4.1 VERWENDETE PLASMIDE 2.
CHARAKTERISIERUNG VON ZELLEN MITTELS DURCHFLUSZYTOMETRIE 2.1 NACHWEIS
DES OBERFLAECHENANTIGENS F4/80 2.2 BESTIMMUNG DER VITALITAET MITTELS
PROPIDIUMIODID 2.3 BESTIMMUNG DER PHAGOZYTOSEAKTIVITAET 2.3.1 LOESUNGEN
2.3.2 DURCHFUEHRUNG 3. PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER NITRITPRODUKTION 3.1
BEHANDLUNG DER ZELLEN 3.1.1 VERWENDETE STIMULANTIEN 3.1.2 DURCHFUEHRUNG
3.2 NITRITBESTIMMUNG 3.2.1 LOESUNGEN 3.2.2 DURCHFUEHRUNG 3.2.3 UV/VIS
SPEKTRUM DER PHOTOMETRISCH ZU BESTIMMENDEN FARBSTOFFLOESUNG 4.
PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER VITALITAET DER ZELLEN 4.1 LOESUNGEN 4.1
DURCHFUEHRUNG 25 25 25 25 25 25 26 27 28 28 29 29 29 29 30 30 30 30 31 31
31 31 32 32 33 33 33 33 34 34 35 35 35 5. METHODEN ZUR ISOLIERUNG VON
RIBONUKLEINSAEUREN 36 5.1 EXTRAKTION VON RIBONUKLEINSAEUREN 36 5.1.1
GUANIDINIUMTHIOCYANAT/CAESIUMCHLORID-METHODE 36 5.1.2
PHENOL/CHLOROFORM-METHODE (TRIZOL*-METHODE) 37 5.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNO VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN 37 5.3
GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RIBONUCLEINSAEUREN 37 5.3.1
LOESUNGEN 38 5.3.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 38 5.3.3 FAERBUNG 39 5.4
ISOLIERUNG VON POLY(A)*-RNA (MRNA) 39 6. NORTHERN BLOT 39 6.1
AMPUFIZIERUNG EINER DNA-NORTHERN BLOT PROBE 39 6.1.1 PRAEPARATION
KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 39 6.1.2 TRANSFORMATION VON E. COLI 40 6.1.3
SCHNELLISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 40 6.1.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 41
6.1.5 PLASMIDISOLIERUNG UND REINIGUNG MITTELS SAEULENCHROMATOGRAPHIE 41
6.2 IN VMO TRANSKRIPTION MIT RADIOAKTIVEN NUKLEOTIDEN 42 6.2.1 SPALTUNG
VON PLASMIDEN MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 42 6.2.2 SYNTHESE EINER
RADIOAKTIV MARKIERTEN CRNA 43 6.2.3 REINIGUNG DER CRNA MITTELS
SAEULENCHROMATOGRAPHIE 43 6.3 NORTHERN BLOT 44 6.3.1 CDNA-PROBEN 44 6.3.2
LOESUNGEN 44 6.3.3 TRANSFER ELEKTROPHORETISCH AUFGETRENNTER RNA AUF EINE
NYLON-MEMBRAN 45 6.3.4 DURCHFUEHRUNG 45 6.3.5 BESTIMMUNG DER STABILITAET
VON MRNA 45 7. REVERSE TKANSKRUTASE POLYMERASE KETTENREAKTION (RT-PCR)
46 7.1 REVERSE TRANSKRIPTION 46 7.2 AMPLIFCOERUNG SPEZIFISCHER
CDNA-TEMPLATES 47 7.2.1 VERWENDETE PRIMER 47 7.2.2 POLYMERASE-REAKTION
47 7.3 UNTERSUCHUNG DER AMPLIFIKATIONSPRODUKTE 48 7.3.1
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE MIT AUTORADIOGRAPHIE 48 7.3.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE MIT ETHIDIUMBROMIDFAERBUNG 49 8.
RADIOIMMUNOASSAY (RIA) UND ENZYMIMMUNOASSAY (EIA) 4 9 8.1 NACHWEIS VON
ZYKLISCHEM GUANOSINMONOPHOSPHAT (CGMP) MITTELS RIA 49 8.1.1 LOESUNGEN 49
8.1.2 EXTRAKTION VON CGMP AUS DEN ZELLEN 50 8.1.3 DURCHFUEHRUNG DES RIA
50 INHALTSVERZEICHNIS 8.2 NACHWEIS VON PROSTAGLANDIN E 2 (PGE2) MITTELS
EIA 51 8.2.1 LOESUNGEN 51 8.2.2 DURCHFUEHRUNG DES EIA 51 9. UNTERSUCHUNGEN
ZUR NP-REZEPTORBINDUNG 52 9.1 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN BINDUNG VON
RADIOAKTIV MARKIERTEM ANP AN GANZEN ZELLEN 52 9.1.1 LOESUNGEN 52 9.1.2
DURCHFUEHRUNG 52 10. UNTERSUCHUNG DER STABILITAET NATRIURETISCHER PEPTIDE
MITTELS HOCHDRUCKFLOSSIG - KERRSCHROMATOGRAPHIE (HPLC) 52 10.1 ZUSATZ
RADIOAKTIV MARKIERTER PEPTIDE ZU DEN ZELLEN 52 10.1.1 LOESUNGEN 52 10.1.2
INKUBATION DER ZELLEN 53 10.2 HPLC-AUFTRENNUNG 53 10.2.1 SAEULE UND
APPARATUR 53 10.2.2 ELUTIONSBEDINGUNGEN UND QUANTITATIVE AUSWERTUNG 53
11. MESSUNG DER AKTIVITAET DER INDUZIERBAREN NO-SYNTHASE 53 11.1
AKTIVITAETSMESSUNG 53 11.1.1 LOESUNGEN 54 11.1.2 HERSTELLUNG DES
ZELLHOMOGENATS 54 11.1.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 54 11.1.4
REAKTIONSANSATZ 54 11.2 AUFTRENNUNG UND QUANTIFIZIERUNG DER
REAKTIONSPRODUKTE 55 11.2.1 SAEULENMATERIAL 55 11.2.2 DURCHFUEHRUNG DER
TRENNUNG 55 12. DCTEKTION VON PROTEINEN MITTELS WESTERN BLOT 56 12.1
PROBENVORBEREITUNG 56 12.1.1 LOESUNGEN 56 12.1.2 DURCHFUEHRUNG 56 12.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 57 12.2.1 LOESUNGEN 57 12.2.2
DURCHFUEHRUNG 58 12.3 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION DURCH WESTERN-BLOT 58
12.3.1 LOESUNGEN 58 12.3.2 PROTEIN-TRANSFER DURCH SEMIDRY-BLOTTING MIT
DISKONTINUIERLICHEM PUFFERSYSTEM 59 12.3.3 VERWENDETE ANTIKOERPER 59
12.3.4 INKUBATION MIT ANTIKOERPERN UND CHEMOLUMINESZENZ-DETEKTION 59
INHALTSVERZEICHNIS 13. NACHWEIS VON PROTEINEN MITTELS IMMUNFLUORESZENZ
13.1 NACHWEIS DER INDUZIERBAREN NO-SYNTHASE IN LPS-STIMULIERTEN ZELLEN
14. NACHWEIS VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 14.1 PRAEPARATION VON NUKLEAREM
PROTEIN 14.1.1 LOESUNGEN 14.1.2 DURCHFUHRUNG 14.1.3 PROTEINBESTIMMUNG
NACH LOWRY 14.2 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 14.2.1
VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 14.2.2 DURCHFUEHRUNG 14.3 BINDUNGSREAKTION UND
GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG 14.3.1 LOESUNGEN 14.3.2 BINDUNG VON
NUKLEAREM PROTEIN UND RADIOAKTIVEM OLIGONUKLEOTID 14.3.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 60 60 60 60 61 61 61 62 62 62 63 63 63
63 C. ERGEBNISSE _65 1. DIE HEMMUNG DER NO-PRODUKTION DURCH ANP 1.1
MAKROPHAGEN-PRIMAERKULTUREN 1.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER ZELLEN MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE 1.1.2 DOSISABHAENGIGE, LPS- INDUZIERTE
NITRITAKKUMULATION 1.1.3 HEMMUNG DER NO-SYNTHESE DURCH ANP 1.2
MAKROPHAGEN-ZELLINIEN 1.3 AUSSCHLUSS EINES ZYTOTOXISCHEN EFFEKTS 2.
EXPRESSION DER REZEPTOREN DER NATRIURETISCHEN PEPTIDE IN MAKROPHAGEN 2.1
NACHWEIS DER MRNA DER NP-REZEPTOREN 2.1.1 NORTHERN BLOT 2.1.2 RT-PCR 2.2
CGMP-PRODUKTION - RIA 2.2.1 CGMP-BILDUNG NACH ANP-STIMULATION 2.2.2
LOESLICHE GUANYLATZYKLASE 2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR NP-REZEPTORBINDUNG 3.
REZEPTORSELEKTTVITAET DES EFFEKTS VON ANP AUF DIE NO-PRODUKTION 3.1
CGMP-ANALOGA 3.2 ANTAGONISTEN DER CGMP-PRODUKTION 3.2.1 HS-142-1 3.2.2
LY 83583 3.3 EINFLUSS EINES NPR-C-LLGANDEN 65 65 65 67 67 67 69 69 69
69 72 72 72 72 75 75 75 75 75 77 77 INHALTSVERZEICHNIS 4. DIE WIRKUNG
ANDERER NATRIURETISCHER PEPTIDE AUF DIE NO-SYNTHESE 4.1 ATRIOPEPTIN I,
URODILATIN UND CNP 4.2 STABILITAETSUNTERSUCHUNG DER NATRIURETISCHEN
PEPTIDE 4.2.1 NACHWEIS DER NATRIURETISCHEN PEPTIDE MITTELS HPLC 4.2.2
VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUR STABILITAET VON ANP UND CNP 4.3 NACHWEIS
VON NPR-B ISOFORMEN 5. MECHANISMUS DER ANP-VERMTITELTEN HEMMUNG DER
NO-SYNTHESE 5.1 ZEITABHAENGIGKEIT DER NO-SYNTHESE-HEMMUNG 5.2 DER EINFLUB
VON ANP AUF DIE AKTIVITAET DER INOS 5.2.1 SPEZIFISCHE AKTIVITAET 5.2.2
ENZYMAKTIVITAET 5.3 NACHWEIS DER INOS MITTELS WESTERN BLOT 5.3.1
ZEITABHAENGIGKEIT DER INOS-EXPRESSION 5.3.2 EINFLUSS VON ANP AUF DIE
INOS-EXPRESSION 5.3.3 NACHWEIS VON INOS MONOMER UND DIMER 5.4 NACHWEIS
DER INOS MITTELS IMMUNFLUORESZENZ 5.5 NACHWEIS DER INOS MRNA MITTELS
NORTHERN BLOT 5.5.1 ZEITVERLAUF DER EXPRESSION DER INOS MRNA 5.5.2
EINFLUSS VON ANP AUF DIE EXPRESSION DER INOS MRNA 5.5.3 EINFLUSS VON ANP
AUF DIE STABILITAET DER INOS MRNA 5.6 DIE AKTIVIERUNG VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN - EMSA 5.6.1 ZEIT- UND DOSIS VERLAUF DER
AKTIVIERUNG VON NF-KB 5.6.2 EINFLUSS VON ANP 5.6.3 EINFLUSS VON
CGMP-ANALOGA 6. AUTOKRINE REGULATION DER NO-SYNTHESE DURCH ANP 77 77 79
79 79 83 83 83 85 85 85 87 87 87 87 90 90 90 90 92 92 92 95 95 97 7.
EINFLUSS VON ANP AUF DIE CYCLOOXYGENASE II 7.1 DIE BILDUNG VON
PROSTAGLANDIN E 2 - EIA 7.1.1 DOSISABHAENGIGKEIT DER PGE2-PRODUKTION
7.1.2 EINFLUSS VON ANP AUF DIE PG^-PRODUKTION 7.2 NACHWEIS DER COX II
MITTELS WESTERN BLOT 7.2.1 ZEITABHAENGIGKEIT DER COX II-EXPRESSION 7.2.2
EINFLUSS VON ANP AUF DIE EXPRESSION DER COX II 7.3 NACHWEIS DER COX N
MRNA MITTELS NORTHERN BLOT 7.3.1 ZEITVERLAUF DER EXPRESSION DER COX II
MRNA 7.3.2 EINFLUSS VON ANP AUF DIE EXPRESSION DER COX N MRNA 97 97 97 99
99 99 99 102 102 102 N. DISKUSSION 103 1. DIE HEMMUNG DER NO-PRODUKTION
IN VERSCHIEDENEN MAKROPHAGENTYPEN DURCH ANP 103 INHALTSVERZEICHNIS 2.
EXPRESSION DER REZEPTOREN DER NATRIURETISCHEN PEPTIDE IN MAKROPHAGEN 104
3. DIE EFFEKTE ANDERER NATRIURETISCHER PEPTIDE AUF DIE NO-PRODUKTION 105
4. NPR-A ALS VERMITTELNDER REZEPTOR DER NO-LNHJBITION DURCH ANP 106 5.
MECHANISMUS DER ANP-VERMITTELTEN HEMMUNG DER NO-SYNTHESE 107 5.1
VERGLEICH DER ZEITABHAENGIGKEIT DES ANP-EFFEKTS MIT KLASSISCHEN
INOS-INHIBITOREN 107 5.2 REDUZIERTE INOS PROTEIN- UND MRNA MENGEN NACH
ANP-BEHANDLUNG 107 5.3 VERRINGERTE AKTIVIERUNG DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS
NF-KB 109 6. AUTOKRINE REGULATION DER NO-SYNTHESE DURCH ANP 7. EINFLUB
VON ANP AUF DIE CYCLOOXYGENASE II 8. AUSBLICK AUF MOEGLICHE
THERAPEUTISCHE ANSATZPUNKTE 111 112 113 E. ZUSAMMENFASSUNG 115 F. ANHANG
117 1. DEFINITIONEN 2. ABKUERZUNGEN 3. ALPKABETISCHE FIRMENLISTE 117 117
121 G. LITERATURVERZEICHNIS 123 1. ZITIERTE VEROEFFENTLICHUNGEN 2. EIGENE
VEROEFFENTLICHUNGEN 2.1 ORIGINALPUBLIKATIONEN 2.2 ABSTRACTS ZU
VORTRAEGENAE OSTERN 123 142 142 142 H. DANKSAGUNGEN 143 I. LEBENSLAUF 144
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