Untersuchungen von Photorezeptorströmen und intrazellulären Ionenkonzentrationen in Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri:
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1997
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UNTERSUCHUNGEN VON PHOTOREZEPTORSTROEMEN
UND INTRAZELLULAEREN IONENKONZENTRATIONEN IN
CHLAMYDOMONAS REINHARDTII UND VOLVOX CARTERI
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III - BIOLOGIE UND VORKLINISCHE
MEDIZIN - DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON FRANZ-JOSEF BRAUN AUS REGENSBURG 1997
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I-Q
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IV
1 ZUSAMMENFASSUNG 1-2
2 EINLEITUNG 3-10
2.1 CHLAMYDOMONAS UND SEINE LICHT-INDUZIERTEN BEWEGUNGSREAKTIONEN 3
2.2 DIE SPHEROIDALE ALGE VOLVOX CARTERI 5
2.3 DER AUGENFLECK 7
2.4 DER EINSATZ VON INTRAZELLULAEREN IONENINDIKATOREN 8
2.5 AUFGABENSTELLUNG 9
3 MATERIAL UND METHODEN 11-33
3.1 DIE ZELLEN 11
3.1.1 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 11
3.1.2 VORBEREITUNG DER ZELLEN FUER SAUGELEKTRODENMESSUNGEN 13
3.1.3 VORBEREITUNG DER ZELLEN FUER DIE BELADUNG MIT
FLUORESZENZFARBSTOFFEN 14 3.1.4 ZEILVITALITAETSTESTS 14
3.1.5 BESTIMMUNG DER GESAMTZELLZAHL 15
3.1.6 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 15
3.1.7 MIKROPHOTOGRAPHIEN 16
3.1.8 KONFOKALE ZELLDARSTELLUNGEN 16
3.2 MESSUNGEN LICHT-INDUZIERTER STROEME MIT DER SAUGELEKTRODENTECHNIK 17
3.2.1 DAS MESSPRINZIP 17
3.2.2 DER MESSAUFBAU 17
3.2.3 DIREKTE MESSUNG VON PHOTOREZEPTORSTROEMEN (P-STROEME) 18
3.2.3.1 P-STROEME IN GANZEN ZELLEN 18
3.2.3.2 P-STROEME IN ISOLIERTEN AUGENVESIKELN 19
3.2.4 DURCHFUEHRUNG DER MESSUNGEN 20
3.2.5 KURVENANPASSUNGEN 22
3.3 UNTERSUCHUNGEN INTRAZELLULAERER IONENKONZENTRATIONEN MIT 23
FLUORESZENZFARBSTOFFEN AN CHLAMYDOMONAS-ZSWEN 3.3.1 DAS MESSPRINZIP 23
3.3.2 BELADUNG VON ZELLEN MIT FLUORESZIERENDEN IONENINDIKATOREN 24
3.3.2.1 DIE 5 WICHTIGSTEN METHODEN DER ZELLBELADUNG 24
3.3.2.2 MOLEKUELSTRUKTUREN DER VERWENDETEN INDIKATOREN 25
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2.3
3.3.3 3.3.3.1 3.3.3.2 3.3.3.3 3.3.3.4
3.3.3.5
3.4
DIE PARAMETER FUER DIE BELADUNG DER ZELLEN MIT AM-ESTER-DERIVATEN DER 27
FARBSTOFFE SPEKTROFLUORIMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN 28
ERMITTLUNG DER KOMPLETTEN (AM-)ESTERHYDROLYSE DER FARBSTOFFE IN DEN
ZELLEN 29 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN FARBSTOFFKONZENTRATION 30
ERMITTLUNG DER CYTOPLASMATISCHEN LOKALISIERUNG DER FARBSTOFFE 31
BESTIMMUNG DER FREIEN CYTOSOLISCHEN IONENKONZENTRATION 31
VERSCHIEDENE BEDINGUNGEN VERAENDERN DIE INTRAZELLULAEREN
IONENKONZENTRATIONEN 32
CHEMIKALIEN
4 ERGEBNISSE
4.1 PHOTOREZEPTORSTROEME IN CHLAMYDOMONAS 4.1.1 DER GESAMTE
PHOTOREZEPTORSTROM (P-STROM) 4.1.2 PHOTOREZEPTORSTROEME IN ISOLIERTEN
AUGENVESIKELN 4.1.3 DIE SAEURE-INDUZIERBARE ZWEITE
PHOTOREZEPTORSTROM-KOMPONENTE (PAI -STROM)
4.2 PHOTOREZEPTORSTROEME IN VOLVOX 4.2.1 BESCHREIBUNG DER MUTANTE FUER DIE
ELEKTRISCHEN MESSUNGEN 4.2.2 LICHT-INDUZIERTE STROEME TRETEN NUR IN
SOMATISCHEN ZELLEN AUF 4.2.3 DER SCHNELLE PHOTOREZEPTORSTROM (P^STROM)
4.2.4 DIE LICHTTITRATIONEN VON VOLVOX (PP-STROM) UND CHLAMYDOMONAS
(P-STROM)
IM VERGLEICH
4.2.5 DER LANGSAME PHOTOREZEPTORSTROM (P S-STROM) 4.2.6 DER STATIONAERE
PHOTOREZEPTORSTROM (PS T-STROM)
4.2.7 MOEGLICHE FLAGELLENSTROEME BEI ERHOEHTER TEMPERATUR
4.3 BELADUNG VON CHLAMYDOMONAS-ZELLEN MIT FLUORESZIERENDEN
IONENINDIKATOREN 4.3.1 ENTSCHEIDENDE PARAMETER FUER DEN BELADUNGSERFOLG
4.3.2 OPTIMIERTE BEDINGUNGEN ZUR BELADUNG VON ZELLEN MIT VERSCHIEDENEN
CALCIUM- UND PH-INDIKATOREN 4.3.3 DER PH-INDIKATOR BCECF 4.3.4 DER
CALCIUM-INDIKATOR FURA-2
33
34-79
34 34 37 39
43 44 45 47 51
56
57
60
61 62 66
67 70
5 DISKUSSION 80-106
5 I ERSTE CHARAKTERISIERUNG DER PHOTOREZEPTORSTROEME IN VOLVOX 80-
5.1.1 EINE KLASSIFIZIERUNG DER PHOTOREZEPTORSTROEME 80
5.1.2 DIE REGULATION DER PHOTOREZEPTORSTROEME 81
5 1.3 DAS AUFTRETEN VON PHOTOREZEPTORSTROEMEN IST ENTWICKLUNGSSPEZIFISCH
91
5 2 KINETIK UND KOMPONENTEN DES PHOTOREZEPTORSTROMS IN CHLAMYDOMONAS 92
5.2.1 DIE KINETIK DES PHOTOREZEPTORSTROMS 92
5.2.2 DIE LOKALISATION UND REGULATION DER PHOTOREZEPTOR-KANAELE 94
5.2.3 DIE SAEURE-INDUZIERBARE NEUE KOMPONENTE DES PHOTOREZEPTORSTROMS 96
(PARSTROM)
5.3 UNTERSCHIEDE ZWISCHEN DER PHOTOREZEPTION IN CHLAMYDOMONAS UND VOLVOX
98
5.4 VERWENDUNG FLUORESZIERENDER IONENINDIKATOREN IN CHLAMYDOMONAS 5.4.1
QUANTIFIZIERUNG INTRAZELLULAERER CALCIUM- UND PROTONEN-KONZENTRATIONEN
5.4.2 VERBINDUNG VON FLUORESZENZ- UND ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN MESSUNGEN
5.5 AUSBLICK
6 LITERATURVERZEICHNIS
7 LEBENSLAUF
102 102 104
106
107-113
114
4.4 EINFLUSS INTRAZELLULAERER CALCIUM- UND PH-AENDERUNGEN AUF DIE
PHOTOSTROEME 73 (P UND F) IN CHLAMYDOMONAS 4.4.1 VERSCHIEDENE CHEMIKALIEN
VERAENDERN DEN INTRAZELLULAEREN PH-WERT (PH;) 73
4.4.2 VERSCHIEDENE CHEMIKALIEN ERHOEHEN DIE INTRAZELLULAERE
CALCIUM-KONZENTRATION 76 ([CA 2+D
IN
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