Der Kompetitive LDL-Rezeptor-ELISA: Entwicklung und einige Anwendungen
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1997
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I.
INHALT
I.
INHALT
SEITE
[.
INHALT
3
II.
ABKUERZUNGEN
6
III.
EINLEITUNG
8
III.A.
DER
LDL-REZEPTOR
-
SCHLUESSELPROTEIN
DER
CHOLESTERINHOMOEOSTASE
9
III.A.
1.
ENTDECKUNG
DES
LDL-REZEPTORS
9
III.A.2.
STRUKTUR
DES
LDL-REZEPTORS
9
III.A.3.
FUNKTION
DES
LDL-REZEPTORS
12
III.B.
FAMILIAERE
HYPERCHOLESTERINAEMIE
17
III.B.
1.
DIFFERENTIALDIAGNOSE:
FAMILIAERER
APOLIPOPROTEIN
B-100
DEFEKT
19
III.B
.2.
THERAPIE
DER
HYPERCHOLESTERINAEMIE
19
III.C.
PROBLEMSTELLUNG
24
IV.
MATERIAL
UND
METHODEN
27
IV.A.
MATERIAL
27
IV.A.L.
BIOCHEMIKA
27
IV.A.2.
ANTIKOERPER
28
FV.A.3.
INSTRUMENTE
UND
APPARATUREN
28
IV.A.4.
SONSTIGE
MATERIALIEN
29
IV.A.5.
SOFTWARE
29
IV.B.
ISOLIERUNG
DES
LDL-REZEPTORS
AUS
DER
RINDEMEBENNIERE
30
IV.B.L.
PROTEASE-INHIBITOREN
30
IV.B.2.
PROTEINBESTIMMUNG
30
IV.B.2.
1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
30
IV.B.2.2.
MODIFIKATION
DER
LOWRY-METHODE
NACH
BENSADOUN
3
1
IV.B.3.
HERSTELLUNG
VON
BOVINEN
NEBENNIERENRINDEN-HOMOGENATEN
32
IV.B.4.
DIFFERENTIALZENTRIFUGATION
33
IV.B.5.
SOLUBILISATION
DER
MEMBRANPROTEINE
34
IV.B.6.
DEAE-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
36
IV.B.7.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKKTROPHORESE
37
I.
INHALT
IV.B.8.
PROBENVORBEREITUNG
40
IV.B.9.
GELFAERBUNG
NACH
COOMASSIE
41
IV.B.
10.
ELEKTROPHORETISCHER
PROTEINTRANSFER:
WESTERN
BLOT
42
IV.C.
LDL-REZEPTOR-NACHWEIS
44
IV.C.
1.
IMMUNOCHEMISCHE
DETEKTION
DES
LDL-REZEPTORS
44
IV.C.
1.1.
BIOTINYLIERUNG
VON
IMMUNGLOBULINEN
46
IV.C.2.
LDL-LIGANDEN
BLOT
47
IV.C.2.
1.
PRAEPARATION
VON
LOW
DENSITY
LIPOPROTEINEN
(LDL)
47
IV.C.2.
1.1.
DOPPELDIFIFUSION
NACH
OUCHTERLONY
49
IV.C.2.2.
PRAEPARATION
VON
LIPOPROTEIN
DEFLCIENT
SERUM
(LPDS)
50
IV.C.2.3.
L25
JOD-MARKIERUNG
VON
LDL
UND
BESTIMMUNG
DER
MARKIERUNGSEFTIZIENZ
50
IV.C.2.4.
LIGANDEN
BLOT
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
LOW
DENSITY
LIPOPROTEINEN
51
IV.C.3.
45
CALCIUM-BLOT
52
IV.D.
ZELLKULTUR
53
IV.D.
1.
AFONO/AYER-KULTUREN
MENSCHLICHER
FIBROBLASTEN
UND
HEP
G2-ZELLEN
53
IV.D.2.
INKUBATIONSEXPERIMENTE
MIT
MEDIKAMENTEN
54
IV.D.3.
ISOLIERUNG
DES
LDL-REZEPTORS
AUS
FIBROBLASTEN
UND
HEPG2-ZELLEN
55
IV.D.4.
KONZENTRATIONSABHAENGIGE,
REZEPTOR-VERMITTELTE
BINDUNG
DER
L25
J-LDL
AN
FIBROBLASTEN-A/ONO/AYER
56
IV.E.
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
58
IV.E.
1.
EXKURS:
ELISA
58
IV.E.2.
VORBEDINGUNGEN
DES
KOMPETITIVEN-LDL-REZEPTOR-ELISA
'
S
61
IV.E.3.
KOVALENTES
COATING
62
IV.E.4.
KOMPETITION
UND
DETEKTION
66
IV.E.
5.
ELISA-AUSWERTUNG
68
V.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
70
V.A.
ENTWICKLUNG
70
V.A.
1.
ISOLIERUNG
DES
BOVINEN
NEBENNIEREN-LDL-REZEPTORS
70
V.A.2.
DETEKTION
MIT
DEM
MC7-ANTIKOERPER
71
V.A.2.
1.
MINIMIERUNG
DER
UNSPEZIFITAET
74
V.A.3.
LIGANDEN
UND
45
CALCIUM-BLOT
77
V.A.4.
DER
ELISA
IN
DER
EXPERIMENTALPHASE
81
V.A.4.
1.
KONVENTIONELLES
COATING
IN
GEGENWART
VON
OCTYLGLYKOSID
81
4
I.
INHALT
V.A.4.2.
EINFLUSS
DES
DETERGENZ
IM
KOMPETITIVEN
ELISA
84
V.A.4.3.
DETERGENZIEN
IM
VERGLEICH
87
V.A.5.
GLUTARALDEHYD-AKTIVIERTE
POLYSTYROLOBERFLAECHE
90
V.A.6.
KOVALENTE
ANTIGENFIXIERUNG:
COVALINK
94
V.A.6.1.
FUNKTIONALITAET
DES
KOVALENT
GEBUNDENEN
LDL-REZEPTORS:
LDL-BINDUNGSASSAY
98
V.A.6.2.
KOMPETITIONSEXPERIMENTE
100
V.A.6.3.
REPRODUZIERBARKEIT
UND
SENSITIVITAET
104
V.B.
ANWENDUNGEN
108
V.B.L.
ISOLIERUNG
DES
FIBROBLASTEN-LDL-REZEPTORS
108
V.B.2.
LDL-REZEPTORINDUKTION
DURCH
LPDS
109
V.B.3.
KONSTRUKTION
DER
STANDARDKURVE
UND
ELISA-AUSWERTUNG
111
V.B.4.
DER
KOMPETITIVE
LDL-REZEPTOR-ELISA
ALS
DIAGNOSTISCHES
INSTRUMENT
116
V.B.5.
PHARMAKOLOGISCHE
BEEINFLUSSUNG
DER
LDL-REZEPTOREXPRESSION
119
V.B.5.
1.
HMG-COA-REDUKTASE-INHIBITOREN:
WIRKSAMKEIT
UND
WIRKUNGSMECHANISMEN
120
V.B.
5.2.
LIFIBROL
UND
HOE
402:
LIPIDSENKER
DER
NEUSTEN
GENERATION
121
V.B.5.3.
WIRKUNGSSTAERKE-BESTIMMUNG
MIT
DEM
KOMPETITIVEN
LDL-REZEPTOR-ELISA
123
V.B.5.4.
DOSIS-WIRKUNGS-BEZIEHUNG
VON
HOE
402
AN
FIBROBLASTEN
126
V.B.6.
HEP
G2-ZELLEN
ALS
IN
VIRRO-MODELL
HEPATISCHER
STOFFWECHSEL
UND
REGULATIONSVORGAENGE
129
V.B.6.1.
KOMPETITIVER
ASSAY
MIT
SOLUBILISIERTEN
HEP
G2-LDL-REZEPTOREN
130
V.B.6.2.
PHARMAKOLOGISCHE
BEEINFLUSSUNG
DER
HEP
G2-LDL-REZEPTOREN
132
V.B.
7.
STEROLABHAENGIGE
REGULATION
DER
LDL-REZEPTORGEN-TRANSKRIPTION
135
V.B.
8.
POSTTRANSKRIPTIONALE
REGULATION
DER
LDL-REZEPTOREXPRESSION
136
V.B.
8.1.
DAS
MODELL
3-HYDROXY-3-METHYLGLUTARYL-COENZYM
A-REDUKTASE
137
V.B.9.
STEROLUNABHAENGIGE
TRANSKRIPTION
DES
LDL-REZEPTORGENS
139
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
142
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
145
VIII.
ANHANG
I
UND
II
173
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