Identifizierung und Charakterisierung cis-aktiver DNA-Sequenzen der Penicillinbiosynthesegene acvA und ipnA von Aspergillus nidulans:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
1.
PENICILLIN:
ANTIBIOTIKUM
UND
SEKUNDAERMETABOLIT
1
2.
ENZYME
DER
PENICILLINBIOSYNTHESE
2
3.
SS-LACTAM-BIOSYNTHESEGENCLUSTER
S
4.
REGULATION
DER
SS-LACTAM-BIOSYNTHESE
6
4.1.
EXPRESSIONSMUSTER
DER
BIOSYNTHESEGENE
6
4.2.
REPRESSION
DURCH
GLUCOSE
7
4.3.
REPRESSION
DURCH
AMMONIUM
8
4.4.
REGULATION
DURCH
DEN
PH-WERT
DES
MEDIUMS
8
4.5. REGULATION
DURCH
VERSCHIEDENE
AMINOSAEUREN
10
4.6.
WEITERE
POTENTIELLE
TRANS-AKTIVE
FAKTOREN
IN
DER
PENICILLINBIOSYNTHESE
11
5.
ZIEL
DER
ARBEIT
12
MATERIAL
UND
METHODEN
1.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
13
1.1
BAKTERIENSTAEMME,
PILZSTAEMME
UND
PLASMIDE
13
1.2.
NAEHRMEDIEN
16
1.3.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
17
1.4.
HERSTELLUNG
VON
SPORENSUSPENSIONEN
18
1.5.
DURCHFUEHRUNG
SEXUELLER
KREUZUNGEN
18
1.6.
TROCKENGEWICHTSBESTIMMUNG
18
2.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
19
2.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
19
2.1.1.
PLASMID-DNA
19
2.1.2.
CHROMOSOMALE
DNA
VON
PILZEN
19
2.1.3.
RNA
VON
ASPERGILLUS
NIDULANS
19
2.1.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
20
2.2.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
20
2.3.
KLONIERUNGEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
20
2.3.1.
ENZYMATISCHE
IN
VFTRO-REAKTIONEN
20
2.3.2.
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COFCZELLEN
21
2.4.
DNA-SEQUENZIERUNG
21
2.5.
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
("SOUTHERN
BLOF-ANALYSE)
21
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.6.
IN
V/FRO-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
[
32
P]
21
2.7.
"PRIMER
EXTENSION'-ANALYSE
22
2.8.
DNA-AMPLIFIKATION
MIT
HILFE
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
22
2.8.1.
DNA-AMPLIFIKATION
ZUR
ISOLIERUNG
AUSGEWAEHLTER
DNA-FRAGMENTE
22
2.8.2.
EINFUEHRUNG
SPEZIFISCHER
MUTATIONEN
MIT
HILFE
DER
PCR-AMPLIFIKATION
23
2.9.
TRANSFORMATION
VON
ASPERGILLUS-STAEMMEN
24
2.9.1.
TRANSFORMATION
VON
A.
NIDULANS
24
2.9.2.
TRANSFORMATION
VON
A.
NIGER
24
3.
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNMETHODEN
24
3.1.
ELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
AGAROSEGEFEN
24
3.2.
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
IN
HAMSTOFF-POLYACRYLAMIDGELEN
24
3.3.
ELEKTROPHORESE
VON
DNA/PROTEIN-KOMPLEXEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
25
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
3.4.
ELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
25
4.
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
UND
DES
PENLCLLLINTITERS
26
4.1.
SS-GLUCURONIDASE-AKTIVITAET
26
4.2.
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
26
4.3.
OMITHIN-TRANSCARBAMOYLASE-AKTIVITAET
26
4.4.
SAURE
UND
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
26
4.5.
PENICILLIN
27
5.
WEITERE
BIOCHEMISCHE
METHODEN
27
5.1.
PROTEINBESTIMMUNG
27
5.2.
HERSTELLUNG
VON
A.
N/DU/ANS-PROTEINEXTRAKTEN
28
5.3.
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
28
5.4.
METHYL-INTERFERENZ-ANALYSE
29
5.5.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
("WESTERN
BLOT*-ANALYSE)
29
6.
LISTE
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTLDE
30
7.
BEZUGSQUELLEN
BESONDERER
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
32
INHALTSVERZEICHNIS
III
ERGEBNISSE
1.
KONSTRUKTION
VON
DELETIONSKLONEN
UND
33
STANDARDISIERUNG
DER
ANZUCHTBEDINGUNGEN
1.1.
KONSTRUKTION
VON
TRANSLATIONALEN
GENFUSIONEN
1
2~
ERZEUGUNG
VERSCHIEDENER
DELETIONSKONSTRUKTE
1.3.
TRANSFORMATION
VON
A
NIDULANS
MIT
DEN
VERSCHIEDENEN
PLASMIDEN
1.4.
STANDARDISIERUNG
DER
FERMENTATIONSBEDINGUNGEN
2.
IDENTIFIZIERUNG
UND
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
EINES
CFO-AKTIVEN
DNA-ELEMENTES
2.1.
IDENTIFIZIERUNG
C/S-AKTIVER
SEQUENZBEREICHE
MITTELS
VERSCHIEDENER
DELETIONSKLONE
22.
IDENTIFIZIERUNG
EINER
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNG
INNERHALB
DES
SEQUENZBEREICHES
353
BIS
432
2.3.
EINGRENZUNG
DER
PENR1-BINDESTELLE
DURCH
IN
WFRO-EXPERIMENTE
2.3.1.
IDENTIFIZIERUNG
DER
PENR1
-BINDESTELLE
MIT
EINER
METHYL-INTERFERENZ-ANALYSE
2.3.2.
MUTATIONSANALYSE
DER
PENR1
-BINDESTELLE
2.4.
EFFEKTE
EINER
4
BP-DELETION
IN
DER
PENR1
-BINDESTELLE
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
2.4.1.
KONSTRUKTION
ZWEIER
4
BP-LANGER
DELETIONEN
IN
DER
INTERGENEN
REGION
ZWISCHEN
ACVA
UND
IPNA
2.4.2.
AUSWIRKUNGEN
DER
4
BP-DELETIONEN
AUF
DIE
BINDUNG
DURCH
PENR1
UNTER
IN
V/FRO-BEDINGUNGEN
2.4.3.
EFFEKT
DER
CCA-G-DELETION
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
ACVA
UND
/PNA-GENFUSIONEN
IN
VIVO
2.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHYSIOLOGISCHEN
FUNKTION
VON
PENR1
2.5.1.
EXPRESSION
DER
GENFUSIONEN
UEBER
EINEN
ZEITRAUM
VON
120
STUNDEN
2.5.2.
VERWENDUNG
VON
GLUCOSE
ALS
C-QUELLE
2.6.
POTENTIELLE
PENR1-BINDESTELLEN
IN
ANDEREN
SS-LACTAM-PRODUZIERENDEN
PILZEN
3.
EINFLUSS
EXOGEN
ZUGEGEBENER
AMINOSAEUREN
AUF
DIE
EXPRESSION
DES
ACVA
UND
IPNA-GEM
3.1.
AENDERUNGEN
DER
ACVA
UND
RPNA-EXPRESSION
BEI
AMINOSAEUREZUGABE
32.
PENICILLINPRODUKTION
BEI
ZUGABE
AUSGEWAEHLTER
AMINOSAEUREN
3.3.
IDENTIFIZIERUNG
CFS-AKTIVER
DNA-SEQUENZEN
FUER
DIE
REGULATION
69
DURCH
AMINOSAEUREN
8
2
2 8
8
8
8
8
2
8
8
3
8
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
DER
GENE
ACVA
UND
IPNA
IN
EINER
PACC-MUTANTE
(PAC5)
3.4.1.
INDUKTION
DER
ACVA
UND
/PNA-EXPRESSION
IN
DER
PACC5-MUTANTE
3.4.2.
REGULATION
DER
ACVA
UND
IPNA-EXPRESSION
DURCH
AMINOSAEUREN
IN
DER
PACC5-MUTANTE
3.4.3.
ZUSAMMENHANG
ZWISCHEN
GENEXPRESSION
UND
MYZELWACHSTUM
3.5.
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
AMINOSAEUREN
UND
DER
PACC5-MUTATION
AUF
DIE
TRIPEPTIDSYNTHETASE
(ACVS)-MENGE
4.
VERSUCH
DER
/N
V/VO-TITRATION
VON
REGULATORPROTEINEN
5.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
GENE
ACVA
UND
IPNA
IN
ASPERGILLUS
NIGER
5.1.
TRANSFORMATION
VON
A.
N/GERMIT
ACVA-UND
ZPNA-GENFUSIONEN
5.2.
EXPRESSION
DER
GENFUSIONEN
IN
A.
NIGER
5.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REGULATION
DER
GENEXPRESSIONEN
IN
A.
NIGER
DURCH
GLUCOSE
UND
DURCH
VERSCHIEDENE
AMINOSAEUREN
DISKUSSION
8
S
3
9
ZUSAMMENFASSUNG
LITERATURVERZEICHNIS
72
72
74
76
78
80
87
105
107
ANHANG
118 |
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