Entwicklung von Strategien zur Expression von Genen in Säugerzellinien durch gerichtete Integration:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
L
EINLEITUNG
1
1.1
ANWENDUNG
VON
BICISTRONISCHEN
TRANSKRIPTIONSEINHEITEN
ZUR
EXPRESSION
VON
HETEROLOGEN
GENEN
IN
SAEUGERZELLEN
1
1.2
RETROVIREN
UND
RETRO
VIRALER
GENTRANSFER
4
1.3
"
GENE
TARGETING
"
13
1.3.1
HOMOLOGE
REKOMBINATION
13
1.3.2
KONSERVATIVE
SEQUENZSPEZIFISCHE
REKOMBINATION
23
1.4
RIBOZYME
27
1.5
AUFGABENSTELLUNG
32
X
ERGEBNISSE
33
2.1
ANTIKOERPEREXPRESSION
IN
BHK-A
ZELLEN
33
2.1.1
VEKTORKONSTRUKTION
33
2.1.2
EXPRESSION
VON
VOLLSTAENDIGEN
ANTIKOERPERN
IN
BHK-A
ZELLEN
MIT
HILFE
BICISTRONISCHER VEKTOREN
33
2.2
MODELLSYSTEM
FUER
DIE
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
ETABLIERTEN
ZELLINIEN
34
2.2.1
DIE
ELEKTROPORATION
VON
"
TARGETING
"
-VEKTOREN
ALS
GENTRANSFERMETHODE
35
2.2.2
VORVERSUCHE
ZUR
POSITIV
/
NEGATIV
-
SELEKTION
(PNS)
36
2.2.3
MODELL
"
TARGETING
"
39
2.2.3.1
KONSTRUKTION
DES
"
TARGETING
"
-VEKTORS
PTKC5NR3
39
2.2.3.2
ETABLIERUNG
EINER
"
SCREENING
"
-METHODE
AUF
HOMOLOGE
REKOMBINATIONSEREIGNISSE
IN
ZELLKLONEN
40
2.2.3.3
ETABLIERUNG
EINER
METHODE
ZUR
DETEKTION
VON
HOMOLOGEN
REKOMBINATIONSEREIGNISSEN
IN
ZELLKLONGEMISCHEN
43
2.2.3.4
VERSUCH
EINES
MODELL
"
TARGETING
"
46
2.2.3.5
VERBESSERUNG
DER
EFFIZIENZ
DER
POSITIV
/
NEGATIV
-
SELEKTION
48
2.3
INFIZIERBARKEIT
VON
BHK-A
ZELLEN
MIT
RETROVIREN
51
2.4
VERWENDUNG
OPTIMIERTER
RETROVIRALER
VEKTOREN
MIT
DOPPEL-FRT
SEQUENZEN
FUER
DIE
KONSTRUKTION
VON
HOCHEXPRESSIONSZELLINIEN
IN
EINEM
ZWEI-SCHRITT-VERFAHREN
53
2.4.1
HERSTELLUNG
EINES
RETROVIRALEN
VEKTORS,
DER
EINE
POSITIV
/
NEGATIV
-
SELEKTION
ERLAUBT
57
2.4.2
EIN
POSITIV
UND
NEGATIV
SELEKTIERBARER,
DIE
SEKRETIERTE
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
(SEAP)
EXPRIMIERENDER
BICISTRONISCHER
RETROVIRALER
VEKTOR
58
2.4.3
VORKONSTRUKTE
EINES
POSITIV
UND
NEGATIV
SELEKTIERBAREN
BICISTRONISCHEN
RETROVIRALEN
"
SHUTTLE
"
-VEKTORS
58
2.4.4
VORKONSTRUKT
FUER
FLP/FRT-REKOMBINATIONSVEKTOREN
60
2.4.5
HERSTELLUNG
EINES
RETROVIRALEN
BICISTRONISCHEN
"
SHUTDE
"
-
VEKTORS
MIT
DOPPEL-FRT-SEQUENZEN
61
2.4.6
KONSTRUKTION
UND
TEST
DES
"
SCREENING
"
-VEKTORS
PAPTKNEF
64
2.4.7
EXPRCSSIONS
"
SCREENING
"
IN
BHK-A
ZELLEN
65
2.4.8
BESTIMMUNG
DER
KOPIENZAHL
INS
BHK-A
GENOM
INTEGRIERTER
PROVIREN
UND
UEBEIPRUEFUNG
IHRER
VOLLSTAENDIGKEIT
67
2.4.9
HERSTELLUNG
VON
LOCUSSPEZIFISCHEN
SONDEN
MIT
HILFE
INVERSER
PCR
67
2.4.10
FUNKTIONALITAETSTEST
DER
FRT-SEQUENZEN
IN
INFIZIERTEN
BHK-A
ZELLEN
70
2.4.11
KONSTRUKTION
UND
FUNKTIONSANALYSE
DES
BICISTRONISCHEN
"
TARGETING
"
-VEKTORS
PGET
73
2.4.12
DER
"
TARGETING
"
-VEKTOR
PGETHEAD
77
2.4.13
ANALYSE
DER
SELEKTION
MIT
HILFE
DES
"
HAMMERHEAD
"
-
RIBOZYMS
79
2.4.14
"
TARGETING
"
PROVIRALER
LOCI
MIT
PGETHEAD
82
2.4.15
UNTERSUCHUNG
DES
GENOTYPS
DER
SEQUENZSPEZIFISCHEN
REKOMBINANTEN
MIT
HILFE
VON
PCR
83
2.4.16
SOUTHERN-TRANSFER-ANALYSEN
DER
REKOMBINANTEN
85
2.4.17
VERBESSERUNG
DER
EFFIZIENZ
EINER
SEQUENZSPEZIFISCHEN
REKOMBINATION
DURCH
STABILE
EXPRESSION
DER
FLP
REKOMBINASE
86
3.
DISKUSSION
92
3.1
BICISTRONISCBE
VEKTOREN
92
3.2
ETABLIERUNG
EINES
MODELLSYSTEMS
ZUM
AUSTAUSCH
VON
EXPRESSIONS
KASSETTEN
IN
SAEUGERZELLEN
DURCH
HOMOLOGE
REKOMBINATION
92
3.3
RETROVIRALE
INFEKTION
VON
BHK-A
ZELLEN
96
3.4
VERWENDUNG
VON
DOPPEL-FRTS
IM
LTR
VON
RETROVIREN
FUER
DIE
KONSTRUKTION
VON
HOCHPRODUKTIONSZELLINIEN
97
4.
ZUSAMMENFASSUNG
104
5.
DNA-KONSTRUKTE
105
5.1
OLIGONUKLEOTIDE
105
5.2
VERWENDETE PLASMIDE
108
5.3
HERGESTELLTE
PLASMIDE
110
6.
MATERIAL
UND
METHODEN
112
6.1
GERAETE
112
6.2
MATERIAL
114
6.2.1
FILTERPAPIERE
UND
TRANSFERFOLIEN
114
6.2.2
AUTORADIOGRAPHIE
114
6.2.3
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
114
6.2.4
PLASTIKMATERIALIEN
FUER
ZELLKULTIVIERUNG
114
6.2.5
COMPUTERPROGRAMME
114
6.3
ALLGEMEINE
GRUNDTECHNIKEN 115
6.3.1
STERILISIEREN
115
6.3.2
PHENOLISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
115
6.3.3
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
115
6.3.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
115
6.3.4.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
115
6.3.4.2
FLUOROMETRISCHE
BESTIMMUNG
115
6.4
ARBEITEN
MIT
E.
COLI
116
6.4.1
E.
COLI
-
STAEMME
116
6.4.2
KULTURMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
116
6.4.3
HERSTELLUNG
VON
AGARPLATTEN
116
6.4.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
116
6.4.5
ELEKTROTRANSFORMATION
117
6.4.6
KONSERVIEREN
VON
BAKTERIENKOLONIEN
117
6.5
ISOLIERUNG
VON
DNA
117
6.5.1
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
117
6.5.2
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
118
6.5.2.1
"
MINI-PRAEP
"
118
6.5.2.2
KLARE
LYSATE
118
6.5.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
119
6.5.3.1
.UEBER
GLASMILCHBINDUNG
119
6.5.3.2
.UEBER
FILTRATION
MIT
HILFE
EINER
HYBOND-N
MEMBRAN
119
6.5.4.
ISOLIERUNG
VON
HOCHMOLEKULARER
DNA
(HMW-DNA)
AUS
SAEUGERZELLEN
120
6.5.4.1
.FUER
EINE
MODIFIZIERTE
PCR
(ANLEHNEND
AN
KIM
UND
SMITHIES,
1988)
120
6.5.4.2
.FUER
SOUTHERN
TRANSFER,
"
SLOT-BLOT
"
UND
EINE
MODIFIZIERTE
PCR
(ANLEHNEND
AN
ARATANI
ET
AL.
,
1992)
120
6.6
MODIFIKATION
VON
DNA
121
6.6.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
121
6.6.2
AUFFUELLEN
VON
5'-UEBERSTEHENDEN
ENDEN
121
6.6.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
121
6.6.4
T4
POLYNUKLEOTID-KINASE-REAKTIONEN
121
6.6.5
LIGATION
ZUR
TRANSFORMATION
121
6.6.6
MARKIERUNG
VON
DNA
122
6.6.6.1
"
NICK
"
-TRANSLATION
122
6.6.6.2
DNA-MARKIERUNG
MIT
"REDIPRIME"
122
6.6.6.3
KLENOW-MARKIERUNG
123
6.7
DNA-ANALYTIK
123
6.7.1
PCR
(
"
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
"
)
123
6.7.2
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
124
6.7.3
SOUTHERN
TRANSFER
125
6.7.4
"
SLOT-BLOT
"
125
6.7.5
HYBRIDISIERUNG
126
6.8
GELELEKTROPHORESEN
127
6.8.1
AGAROSEGELE
127
6.8.2
SEQUENZIERGELE
127
6.9
ARBEITEN
MIT
SAEUGERZELLKULTUREN
128
6.9.1
VERWENDETE ZELLEN
128
6.9.2
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
128
6.9.3
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
129
6.9.4
PASSAGIEREN
129
6.9.5
LANGZEITLAGERUNG
VON
ZELLEN
129
6.9.6
GENTRANSFERMETHODEN
129
6.9.6.1
TRANSFEKTION
MITTELS
KALZIUMPHOSPHAT
DNA-COPRAEZIPITATION
129
6.9.6.2
TRANSFEKTION
MITTELS
ELEKTROPORATION
130
6.9.6.3
INFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
RETROVIREN
131
6.9.7
DURCHFUEHRUNG
EINER
SELEKTION
131
6.9.8.
ISOLIERUNG
VON
EINZELKLONEN
132
6.10
PROTEINANALYTIK
132
6.10.1
NACHWEIS
UND
BESTIMMUNG
DER
MENGE
VON
ANTIKOERPERN
132
6.10.2
NACHWEIS
VON
SS-GALAKTOSIDASE
DURCH
IN
SITU-FSRBMG
VON
ZELLEN
133
6.10.3
SEAP-NACHWEIS
DURCH
SEAP-FILTERTEST
133
6.10.4
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
VON
SEAP
134
6.10.5
BESTIMMUNG
DER
LUCIFERASE-AKTIVITAET
135
7.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
136
8.
ANHANG
138
9.
LITERATUR
144
LEBENSLAUF
157 |
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