Funktionale Expression des Antigenpeptid-Transporters TAP und Charakterisierung eines ATP-abhängigen Peptidtransportsystems im Endoplasmatischen Retikulum von Saccharomyces cerevisiae:
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
ZUSAMMENFASSUNG
1
B.
EINLEITUNG
3
1.
DIE
TRANSPORTER
DER
ABC-SUPERFAMILIE
3
2.
FUNKTIONEN
PROKARYONTISCHER
ABC-TRANSPORTER
6
3.
DIE
ABC-PROTEINE
DER
BAECKERHEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
7
4.
HUMANE
ABC-PROTEINE:
MEDIZINISCHE
ASPEKTE
10
5.
DER
MHC-KODIERTE
ANTIGENPEPTID-TRANSPORTER
TAP
13
6.
ZIELSETZUNG
18
C.
MATERIAL
UND
METHODEN
19
1.
MATERIAL
19
1.1.
BAKTERIENSTAEMME
UND
MEDIEN
19
1.2.
HEFESTAEMME
UND
MEDIEN
19
1.3.
VERTEBRATENZELLEN
UND
MEDIEN
20
1.4.
PLASMIDE
UND
CDNS
20
1.5.
ENZYME,
ANTIKOERPER
UND
STANDARDS
20
1.6.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
21
1.7.
GERAETE
23
2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
24
2.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNS
24
2.1.1.
MINI-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
24
2.1.2.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
IN
GROESSEREN
MENGEN
24
2.2.
KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
VON
DNS
24
2.3.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
DNS
25
2.3.1.
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
25
2.3.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-DNS-ENDEN
25
2.3.3.
AUFFUELLEN
VON
5'-UEBERHAENGENDEN
DNS-ENDEN
25
2.3.4.
LIGATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
26
2.3.5.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
26
2.3.6.
HERSTELLUNG
DNASE-FREIER
RNASE
27
2.3.7.
HERSTELLUNG
DES
X-BSTEII-LAENGENSTANDARDS
27
2.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNS
27
2.5.
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
28
2.6.
REINIGUNG
UND
FAELLUNG
VON
DNS
28
INHALTSVERZEICHNIS
N
2.6.1.
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
28
2.6.2.
ETHANOLFAELLUNG
28
2.7.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/AZELLEN
NACH
DER
MEHRIONEN-
TECHNIK
UND
TRANSFORMATION
DURCH
HITZESCHOCK
28
2.7.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/AZELLEN
28
2.7.2.
TRANSFORMATION
29
2.8.
KULTIVIERUNG
UND
KONSERVIERUNG
VON
E.
CO/ASTAEMMEN
29
2.9.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
PCR
30
3.
METHODEN
DES
HEFE-EXPRESSIONSSYSTEMS
3
0
3.1.
ANZUCHT
VON
S.
CEREVISIAE
30
3.2.
LITHIUMACETAT-TRANSFORMATION
VON
S.
CEREVISIAE
31
3.2.1.
TRANSFORMATION
NACH
ITO
(MODIFIZIERT)
31
3.2.2.
TRANSFORMATION
NACH
GIETZ
UND
WOODS
31
3.3.
HERSTELLUNG
VON
S.
CEREV/S/AE-DISRUPTIONSMUTANTEN
32
3.3.1.
GEZIELTE
GENDISRUPTION
UND
SELEKTION
VON
TRANSFORMANTEN
32
3.3.2.
PCR-ANALYSE
DER
TRANSFORMANTEN
32
3.4.
KLONIERUNGEN
IN
S.
CEREVISIAE
33
3.4.1.
"IN
V/VO"-KLONIERUNG
33
3.4.2.
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
HEFE-DNS 33
3.4.3.
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
S.
CEREVISIAE
'
34
3.5.
PAARUNGSTEST
34
3.6.
KONSERVIERUNG
VON
HEFESTAEMMEN
34
4.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
35
4.1.
IMMUNO-BOTS
-
35
4.1.1.
IMMUNO-BLOTS
NACH
DER'ECL-METHODE
35
4.1.2.
"
STRIPPEN"
VON
IMMUNO-BLOTS
35
4.2.
IMMUNPRAEZIPITATION
36
4.3.
IMMUNFLUORESZENZ
AN
S.
CEREVISIAE-ZELLEN
5.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
3
7
5.1.
PRAEPARATION
VON
GESAMTMEMBRANEN
AUS
HEFEZELLEN
37
5.2.
SUBZELLULAERE
FRAKTIONIERUNG
VON
HEFEZELLEN
37
5.3.
PRAEPARATION
VON
MIKROSOMEN
38
5.4.
PLASMAMEMBRAN-PRAEPARATION
NACH
SERRANO
38
5.5.
TNP-PRAEZIPITATION
VON
PLASMAMEMBRAN-PROTEINEN
39
5.6.
PEPTIDBINDUNG
AN
MIKROSOMEN
39
5.7.
PEPTIDTRANSPORT
IN
MIKROSOMEN
40
III
INHALTSVERZEICHNIS
5.7.1.
TRANSPORT
VON
NICHT-GLYKOSYLIERBAREN
PEPTIDEN
40
5.7.2.
TRANSPORT
VON
GLYKOSYLIERBAREN
PEPTIDEN
41
5.8.
PHOTOMARKIERUNG
MIT
8-[A
32
P]-AZIDO-ATP
41
5.9.
BINDUNG
VON
PHOTO-AKTIVIERBAREN
PEPTIDEN
42
6.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
42
6.1.
PROTEINBESTIMMUNG
42
6.1.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
42
6.1.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
(MODIFIZIERT)
42
6.2.
TCA-FAELLUNG
VON
PROTEINEN
43
6.3.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
NACH
LAEMMLI
43
6.4.
PROTEINFAERBUNG
43
6.4.1.
KOLLOIDALE
COOMASSIE-FAERBUNG
NACH'
NEUHOFF
43
6.4.2.
SILBERFAERBUNG
NACH
KJILDT
UND
URBAN
44
6.4.3.
PONCEAU
S-FAERBUNG
44
6.5.
TROCKNEN
VON
POLYACRYLAMID-GELEN
45
6.6.
ELEKTRO-PROTEINTRANSFER
AUF
NITROZELLULOSE
45
6.7.
AUFREINIGUNG
VON
PROTEINEN
45
6.7.1.
ISOLATION
MITTELS
METALLCHELAT-CHROMATOGRAPHIE
45
6.7.2.
ISOLATION
MITTELS
AVIDIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
46
6.7.3.
ISOLATION
VON
ATP-BINDENDEN
PROTEINEN
MIT
ATP-AGAROSE
46
6.8.
LODIERUNG
VON
PEPTIDEN
47
7.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
48
7.1.
GDPASE/CDPASE-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
48
7.2.
A-MANNOSIDASE-BESTIMMUNG
48
7.3.
CYTOCHROM
C-REDUKTASE-BESTIMMUNG
49
8.
HYBRIDOMA-ZELLKULTUR
49
INHALTSVERZEICHNIS
J
V
D.
ERGEBNISSE
50
1.
EXPRESSION
DES
HUMANEN
PEPTIDTRANSPORTERS
TAP
IN
DER
BAECKERHEFE
5
0
1.1.
EXPRESSIONSKONSTRUKTE
VON
HUMANEM
TAP
FUER
S.
CEREVISIAE
50
1.2.
NACHWEIS
VON
REKOMBINANTEM
TAP
51
1.3.
ASSEMBLIERUNG
VON
TAP.1
UND
TAP2
IN
HEFEMEMBRANEN
53
1.4.
LOKALISATION
DES
TAP-PEPTIDTRANSPORTERS
IN
HEFEZELLEN
55
1.4.1.
SUBZELLULAERE
FRAKTIONIERUNG
55
1.4.2.
TNP-MARKIERUNG
VON
PLASMAMEMBRAN-PROTEINEN
57
1.5.
FUNKTIONALITAET
DES
TAP-KOMPLEXES
IN
HEFE
59
1.5.1.
/N
V/FRO-PEPTIDTRANSPORT
IN
HEFEMIKROSOMEN
59
1.5.2.
HEMMUNG
DES
TAP-ABHAENGIGEN
PEPTIDTRANSPORTS
DURCH
DAS
HERPES
SIMPLEX-PROTEIN
ICP47
60
1.5.3.
PEPTIDBINDUNG
AN
HEFEMIKROSOMEN
63
1.5.4.
ATP-BINDUNG
DURCH
DEN
TAP-KOMPLEX
65
1.5.5.
VERSUCH
DER
KOMPLEMENTATION
DES
A-PAARUNGSFAKTOR
TRANSPORTERS
STE6
DURCH
TAP
67
1.5.6.
VERSUCH
DES
A-PAARUNGSFAKTOR-EXPORTS
DURCH
TAP
68
1.6.
EXPRESSION
UND
ISOLATION
EINES
TAP2-FUSIONSPROTEINS
MIT
EINER
BIOTIN-AKZEPTORDOMAENE
70
2.
CHARAKTERISIERUNG
EINES
PEPTIDTRANSPORTSYSTEMS
IM
ER
DER
BAECKERHEFE
72
2.1.
LOKALISATION
DER
PEPTIDTRANSPORTAKTIVITAET
72
2.1.1.
SUBZELLULAERE
FRAKTIONIERUNG
72
2.1.2.
SEPARIERUNG
VON
PLASMAMEMBRAN
UND
ER
75
2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DES
ER-PEPTIDTRANSPORTS
76
2.2.1.
ENERGETISIERUNG
DES
TRANSPORTS
DURCH
NUKLEOSIDTRIPHOSPHATE
76
2.2.2.
SUBSTRATSAETTIGUNG
DES
PEPTIDTRANSPORTS
77
2.2.3.
ABHAENGIGKEIT
DES
PEPTIDTRANSPORTS
VON
DER
GROESSE
DES
VESIKELVOLUMENS
78
2.2.4.
INHIBITOREN
DES
MIKROSOMALEN
PEPTIDTRANSPORTS
78
2.2.5.
LAENGENABHAENGIGKEIT
80
2.2.6.
EINFLUSS
DES
FREIEN
N
UND
C-TERMINUS
DER
PEPTIDE
81
2.3.
DER
PEPTIDTRANSPORT
WIRD
NICHT
DURCH
DAS
PROTEINTRANSLOCON
DES
HEFE-ER
VERMITTELT
82
2.4.
IDENTIFIZIERUNG
EINES
TRANSPORT-DEFIZIENTEN
HEFESTAMMS
84
2.5.
KLONIERUNG
UND
FUNKTIONALE
EXPRESSION
DES
ABC-PROTEINS
YLL048
86
INHALTSVERZEICHNIS
V
2.5.1.
EXPRESSION
EINES
MYC-FUSIONSPROTEINS
IN
DEM
AEYLL048
DELETIONSSTAMM
86
2.5.2.
WIEDERHERSTELLUNG
DES
PEPTIDTRANSPORTS
DURCH
REKOMBINANTES
YLL048
88
2.5.3.
LOKALISATION
DES
MYC-FUSIONSPROTEINS
89
2.6.
EXPRESSION
VON
TAP1
UND
TAP2
IN
DER
4Y//048-DELETIONSMUTANTE
91
E.
DISKUSSION
94
F.
LITERATURVERZEICHNIS
109
G.
ANHANG
128 |
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