Transkriptionsanalyse des dnaK-Locus von Bacillus subtilis:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VI, 161 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
A
ZUSAMMENFASSUNG
1
A
SUMMARY
3
B
EINLEITUNG
UND
PROBLEMSTELLUNG
5
1
EINLEITUNG
5
1.1
DIE
HITZESCHOCKANTWORT
5
1.2
DIE
HITZESCHOCKPROTEINE
5
1.3
MOLEKULARE
CHAPERONE
5
1.4
EINTEILUNG
DER
HITZESCHOCKPROTEINE
6
1.4.1
DIE
HSP90-KLASSE
6
1.4.2
DIE
HSP70-KLASSE
7
1.4.3
DIE
HSP60-KLASSE
8
1.4.4
DIE
KLASSE
DER
KLEINEN
HITZESCHOCKPROTEINE
9
1.4.5
FUNKTIONEN
ANDERER
HSPS
9
1.5
MECHANISMEN
ZUR
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
10
1.5.1
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
BEI
EUKARYONTEN
10
1.5.2
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
BEI
E.
COLI
11
1.5.3
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
BEI
B.
SUBTILIS
13
1.6
DAS
B.
SUBTILIS
DNAK-OPERON
15
1.7
DIE
REGION
STROMAUFWAERTS
DES
B.
SUBTILIS
DNAK-OPERONS
17
2
PROBLEMSTELLUNG
18
C
MATERIALIEN
UND
METHODEN
19
1
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
19
I.I
BAKTERIENSTAEMME
19
1.2
PLASMIDE
20
2
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
UND
B.
SN/ FT7IS-MUTANTEN
22
2.1
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
22
2.1.1
KONSTRUKTION
VON
PGHACLA
22
2.1.2
KONSTRUKTION
VON
PARC.4RPT3
22
2.1.3
KONSTRUKTION
VON
PGRPRPT3
23
2.1.4
KONSTRUKTION
VON
PDNAJRPTL
23
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.1.5
KONSTRUKTION VON
POR/50RPT3
23
2.1.6
KONSTRUKTION VON
PBLUESAZISMALA
23
2.1.7
KONSTRUKTION VON
POR/35RPT3
24
2.1.8
KONSTRUKTION
VON
POR/2SRPT7
24
2.1.9
KONSTRUKTION
VON
PPTOL
24
2.1.10
KONSTRUKTION
VON
PORSS5:.CAT
25
2.1.11
KONSTRUKTION
VON
PORF28:
:CAT
25
2.1.12
KONSTRUKTION
VON
PORSS0'.:CAT
25
2.1.13
KONSTRUKTION
VON
P
'
DNAKDNAJ
26
2.1.14
KONSTRUKTION
VON
PDNAK-CAT-DNAJ
26
2.2
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBRI/IS-MUTANTEN
27
2.2.1
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
LEPATS
27
2.2.2
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
PT01
27
2.2.3
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
ORSS5\-.CAT,
B.
SUBTILIS
ORFLS-.-.CAT
'
28
UND
B.
SUBTILIS
ORSSO::CAT
2.2.4
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
DNAJ.'.CAT
UND
B.
SUBTILIS
DNAK-CAT-DNAJ
29
3
WACHSTUMSMEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
29
3.1
WACHSTUMSMEDIEN
29
3.2
ANTIBIOTIKA-LOESUNGEN
31
3.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
32
4
BEZUGSQUELLEN
FUER
MATERIALIEN
UND
GERAETE
32
5
GENETISCHE
METHODEN
34
5.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
34
5.1.1
STANDARDMETHODE
NACH
COHEN
ET
AL.
34
5.1.1.1
CACLJ-KOMPETENZBEHANDLUNG
VON
CO/R-ZELLEN
34
5.1.1.2
HERSTELLUNG
DAUERKOMPETENTER
.
COZI-ZELLEN
34
5.1.1.3
TRANSFORMATION
34
5.1.2
TRANSFORMATION
MITTELS
ELEKTROPORATION
35
5.1.2.1
HERSTELLUNG
DER
ZELLEN
FUER
DIE
ELEKTROPORATION
35
5.1.2.2
ELEKTROTRANSFORMATION
MIT
PLASMID-DNA
36
5.2
IDENTIFIZIERUNG
REKOMBINANTER
KLONE
MITTELS
YYBLUE-WHITE-SCREENING
"
36
5.3
TRANSFORMATION
VON
B.
SUBTILIS
37
5.3.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
B.
SUBTILIS-ZEWEN
37
5.3.2
TRANSFORMATION
37
5.4
ANLEGEN
VON
GLYCERIN-DAUERKULTUREN
38
5.5
BESTIMMUNG
VON
SPORULATIONSFREQUENZEN
38
6
BIOCHEMISCHE
METHODEN
38
6.1
ABSORPTIONSMESSUNG
38
6.2
METHODEN
ZUR
ISOLIERUNG
VON
DNA
38
6.2.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
39
INHALTSVERZEICHNIS
III
6.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
KLEINEN
MASSSTAB
39
NACH
HOLMES
UND QUIGLEY (BOILING-PREP)
6.2.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
MITTLEREN
MASSSTAB
(MIDIPREP)
39
6.2.1.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IN
GROSSEM
MASSSTAB
MITTELS
BRIJ/DOC-AUFSCHLUSS
40
6.2.2
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
41
6.2.2.1
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
B.
SUBTILIS
IN
GROSSEM
MASSSTAB
41
6.2.2.2
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
B.
SUBTILIS
IN
KLEINEM
MASSSTAB
42
6.3
SPEZIFISCHE
ENZYMATISCHE
HYDROLYSE
VON
DNA
42
6.4
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
42
6.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
43
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
AUS
KAELBERDARM
6.6
REINIGEN
UND
FAELLEN
VON
DNA
MITTELS
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLPRAEZIPITATION
43
6.7
REINIGUNG
UND
KONZENTRATION
VON
DNA
DURCH
44
ZENTRIFUGATIONSBESCHLEUNIGTE
GELFILTRATION
(SPIN
COLUMN
METHOD)
6.8
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
NEB-T4-DNA-LIGASE
44
6.8.1
LIGATION
STUMPFER
ENDEN
45
6.8.2
LIGATION
UEBERSTEHENDER
ENDEN
45
6.8.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DEM
FAST-LINK
DNA
45
LIGATION
AND
SCREENING
KIT
6.9
AUFFULLEN
UEBERSTEHENDER
DNA-EINZELSTRANGENDEN
(FILL-IN-REACTION)
45
6.10
EXTRAKTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
45
6.11
DIG-MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
46
6.12
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
MITTELS
SOUTHEM-BLOTTING
46
6.13
HYBRIDISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENER
DNA
47
6.13.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTID-SONDEN
47
6.13.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-MARKIERTEN
SSRNA-SONDEN
48
6.14
NACHWEIS
DIG-MARKIERTER
NUKLEINSAEUREN
MITTELS
CHEMILUMINESZENZ
48
6.15
PCR-REAKTION
MIT
DER
AMPLITAQ
DNA-POLYMERASE
49
6.16
SEQUENZIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
50
6.16.1
SEQUENZIERUNGSREAKTIONEN
51
6.16.2
ELEKTROPHORESE
IN
POLYACRYLAMID-HAMSTOFF-GELEN
51
6.16.3
AUTORADIOGRAPHIE
51
6.16.4
ENTWICKLUNG
VON
ROENTGENFILMEN
52
7
ARBEITEN
MIT
RNA
52
7.1
DEPC-BEHANDLUNG
VON
LOESUNGEN
UND
GLASGERAETEN
52
7.2
PROBENENTNAHME
ZUR
RNA-PRAEPARATION
VOR
UND
NACH
HITZESCHOCK
52
7.3
RNA-PRAEPARATION
AUS
B.
SUBTILIS
UND
E.
COLI
53
7.4
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
IN
AGAROSEGELEN
55
7.5
TRANSFER
VON
RNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
56
7.5.1
NORTHEM-BLOT
56
7.5.2
SLOT-BLOT
57
7.6
HERSTELLUNG
DIG-MARKIERTER
RNA-SONDEN
(RIBOPROBES)
57
7.7
HYBRIDISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENER
RNA
MIT
DIG-MARKIERTEN
RNA-SONDEN
59
7.8
REINIGUNG
VON
DIG-MARKIERTEN
RNA-SONDEN
MITTELS
PRAEABSORPTION
59
INHALTSVERZEICHNIS
IV
7.9
DENSITOMETRISCHE
QUANTIFIZIERUNG
VON
SLOT-BLOT-ANALYSEN
60
7.10
PRIMER-EXTENSION
61
8
ARBEITEN
MIT PROTEINEN
62
8.1
GEWINNUNG
VON
DENATURIERTEN
ZELLEXTRAKTEN
AUS
B.
SUBTILIS
62
8.2
PROTEINELEKTROPHORESE
IN
DISKONTINUIERLICHEN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
62
8.3
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMID-GELEN
63
8.4
WESTERN-BLOT
64
8.5
IMMUNOCHEMISCHER
NACHWEIS
MEMBRANGEBUNDENER
PROTEINE
64
D
ERGEBNISSE
66
1
ANALYSE
DER
REGION
STROMAUFWAERTS
DES
B.
SUBTILIS
DNAX-OPERONS
66
I.I
KONSTRUKTION
EINER
ZEP^4-DELETIONSMUTANTE
66
1.2
ANALYSE
DER
TRANSKRIPTIONELLEN
ORGANISATION
VON
LEPA
UND
HEMN
66
1.2.1
WESTEM-BLOT-ANALYSE
DER
B.
SUBTILIS-MUTANTEN
LEPA::CAT,
LEPAA,
HEMN".CAT
UND
HEMNN
67
1.2.2
SLOT-BLOT-ANALYSE
DER
B.
SUBTIZIS-MUTANTE
LEPA.-.CAT
68
1.2.3
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
DER
B.
SUBTILIS-MUTANTEN
LEPA::CAT,
LEPAN,
HEMN'.'.CAT
UND
HEMNIS
69
1.3
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
LEPA
UND
HEMN
AUF
DAS
JNAK-OPERON
72
1.3.1
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
B.
SUBTILIS
LEPA.'.CAT
UND
B.
SUBTILIS
LEPA&
UNTER
HITZESCHOCKBEDINGUNGEN
73
1.3.2
UNTERSUCHUNG
DES
EINFLUSSES
VON
LEPA
UND
HEMN
AUF
DIE
REGULATION
DES
CFRIAK-OPERONS
74
1.4
ANALYSE
DER
AEMA-TRANSKRIPTION
UNTER
ANAEROBEN
BEDINGUNGEN
75
1.4.1
ANALYSE
DER
ZEP^-ZTEMZV-TRANSKRIPTION
UNTER
AEROBEN
UND
ANAEROBEN
BEDINGUNGEN
MITTELS
PRIMER-EXTENSION
75
1.4.2
SLOT-BLOT-ANALYSE
DER
TRANSKRIPTION
VON
LEPA
UND
HEMN
UNTER
AEROBEN
UND
ANAEROBEN
BEDINGUNGEN
77
2
TRANSKRIPTIONSANALYSE
DES
B.
SUBTILIS-DNAK-OPERONS
78
2.1
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
VON
HRCA,
GRPE,
DNAK
UND
DNAJ
78
2.1.1
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
FUER
DIE
HERSTELLUNG
HRCA-,
GRPE
UND
DNAJ
SPEZIFISCHER
RNA-SONDEN
78
2.1.2
NACHWEIS
HRCA-,
GRPE-,
DNAK- UND
T/NAZ-SPEZIFISCHER
TRANSKRIPTE
MITTELS
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
80
2.2
COMPUTERGESTUETZTE
SEQUENZANALYSE
DER
CHROMOSOMALEN
REGION
STROMABWAERTS
VON
DNAJ
83
2.3
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
DER
REGION
STROMABWAERTS
VON
DNAJ
88
2.3.1
KONSTRUKTION VON
PLASMIDEN
FUER
DIE
HERSTELLUNG
ORF35-,
ORFL8
UND
OR/50
SPEZIFISCHER
RNA-SONDEN
88
INHALTSVERZEICHNIS
V
2.3.2
NACHWEIS
ORSS5-,
ORF28
UND
OI/50-SPEZIFISCHER
TRANSKRIPTE
MITTELS
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
88
2.4
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
DER
/NA/-TRANSKRIPTION
IN
B.
SUBTILIS
DNAK.-.CAT
90
2.5
KARTIERUNG
DES
POTENTIELLEN
PROMOTORS
STROMAUFWAERTS
VON
DNAJ
MITTELS
PRIMER-EXTENSION
91
2.6
ANALYSE
DER
STABILITAET
VERSCHIEDENER
TRANSKRIPTE
DES
FRA-OPERONS
VON
B.
SUBTILIS
93
2.6.1
ANALYSE
DER
STABILITAETEN
UNTERSCHIEDLICHER
MRNA-SPEZIES
DES
RFNA-OPERONS
IN
B.
SUBTILIS
VOR
UND
NACH
EINEM
HITZESCHOCK
94
2.6.2
ANALYSE
DER
STABILITAETEN
UNTERSCHIEDLICHER
MRNA-SPEZIES
DES
7NAX-OPERONS
IN
B.
SUBTILIS
CLRCE&DNAK
VOR
UND
NACH
EINEM
HITZESCHOCK
98
2.6.3
ANALYSE
DER
STABILITAETEN
DER
8,0-KB
UND
DER
7,O-KB
MRNA
IN
B.
SUBTILIS
1012
WT
UND
B.
SUBTILIS
CLRCE&DNAK
VOR
UND
NACH
EINEM
HITZESCHOCK
102
2.7
EXPERIMENTE
ZUR
NAEHEREN
CHARAKTERISIERUNG
DER
POSTULIERTEN
MRNA-
PROZESSIERUNG
ZWISCHEN
HRCA
UND
GRPE
103
2.7.1
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDES
PPTOL
104
2.7.2
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
PT01
104
2.7.3
NACHWEIS
DER
PROZESSIERUNG
DES
HRCA-GRPE-BGAB-TNNSKNPTES
IN
B.
SUBTILIS
PT01
105
2.7.4
NACHWEIS
DER
PROZESSIERUNG
DES
HRCA-GRPE-BGAB-TRANSKRIPTES
IN
COLI
N343
1
UND
COLI
N3433
106
2.8
QUANTIFIZIERUNG
DER
MRNA-INDUKTIONSPROFILE
DES
B.
SUBTILIS-DNAK-OPERONS
MITTELS
SLOT-BLOT-ANALYSE
107
3
KONSTRUKTION
UND
ANALYSE
VON
ORSSS-,
ORF28
UND
OR/50-NUILMUTANTEN
109
3.1
KONSTRUKTION
DER
B.
SUBTILIS-MUTANTEN
ORSS5.CAT,
ORF28'.CAT
UND
ORSSO.'.CAT
109
3.2
ANALYSE
DES
WACHSTUMSVERHALTENS
DERB.
SUBLILIS-MUTANTEN
ORSS5:.CAT,
ORFL8-.-.CAT
UND
ORF50:-.CAT
UNTER
HITZESCHOCKBEDINGUNGEN
110
3.3
ANALYSE
DES
EINFLUSSES
VON
ORFL5,
ORFL8
UND
ORFIO
AUF
DIE
REGULATION
DER
KLASSE-I-HITZESCHOCKGENE
VON
B.
SUBTILIS
111
3.4
BESTIMMUNG
VON
SPORULATIONSFREQUENZEN
DER
B.
SUMZIS-MUTANTEN
ORSS5:.CAT,
ORF28-.:CAT
UND
ORSS0-.
-.CAT
113
4
KONSTRUKTION
UND
ANALYSE
VON
B.
SUBTILIS
DNAJV.CAT
UND
B.
SUBTILIS
DNAK-CAT-DNAJ
114
4.1
KONSTRUKTION
VON
B.
SUBTILIS
DNAJ'.'.CAT
UND
B.
SUBTILIS
DNAK-CAT-DNAJ
114
4.2
ANALYSE
DES
EINFLUSSES
VON
GRPE,
DNAK
UND
DNAJ
AUF
DIE
REGULATION
DER
KLASSE-I-HITZESCHOCKGENE
VON
B.
SUBTILIS
115
4.3
ANALYSE
DES
WACHSTUMSVERHALTENS
VON
B.
SUBTILIS
DNAJ::CAT
UNTER
HITZESCHOCKBEDINGUNGEN
116
4.4
ANALYSE
DES
WACHSTUMSVERHALTENS
VON
B.
SUBTILIS
DNAK-CAT-DNAJ
UNTER
HITZESCHOCKBEDINGUNGEN
117
INHALTSVERZEICHNIS
VI
E
DISKUSSION
120
1
ANALYSE
DER
REGION
STROMAUFWAERTS
DES
B.
SUBTILIS
120
DNAAE-OPERONS
2
TRANSKRIPTIONSANALYSE
DES
B.
SUBTILIS
DNAAE-OPERONS
121
2.1
DIE
TRANSKRIPTIONELLE
ORGANISATION
DES
B.
SUBTILIS
DNAK-OPERONS
121
2.2
ANALYSE
VON
ORFOE5,
ORF28
UND
ORFIO
125
2.3
CIRCE
ALS
MRNA-DESTABILISIERENDES
ELEMENT
129
2.4
DIE
PROZESSIERUNGSSTELLE
ZWISCHEN
HRCA
UND
GRPE
131
3
VERGLEICH
DES
B.
SUBTILIS
DNAX-OPERONS
MIT
DNAK
134
OPERONS
ANDERER
BAKTERIEN
4
ANALYSE
VON
B.
SUBTILIS
DNAJ::CAT
UND
137
B.
SUBTILIS
DNAK-CAT-DNAJ
5
SCHLUSSFOLGERUNGEN
UND
AUSBLICK
139
F
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
141
G
LITERATURVERZEICHNIS
144
DANKSAGUNG
160
ERKLAERUNG
161 |
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