Identifizierung und Wechselwirkung von Komponenten des vesikulären Proteintransportes zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Münster
Lit
1998
|
| Schriftenreihe: | Uni-Press
100 |
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| Beschreibung: | III, 152 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
-
.
1
1.1.
GENERELLE
GRUNDLAGEN
DES
VESIKULAEREN
PROTEINTRANSPORTES
.
1
13.
STRUKTURELLE
UND
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
YPT-PROTEINE
.
2
13.
DER
FUNKTIONELLE
ZYKLUS
DER
GTPASEN
.
4
1.4.
KOMPONENTEN
DES
TRANSPORTWEGES
VOM
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUM
ZUM
GOLGI-APPARAT
.
7
13.
WEITERE
YPT-PROTEINE
MIT
SPEZIFISCHEN
FUNKTIONEN
IN
VERSCHIEDENEN
SCHRITTEN
DES
PROTEINTRANSPORTES
.
9
1.6.
ZIELSETZUNG
DIESER
ARBEIT
.
11
2.
MATERIAL
YY
YYYYYYYY**.14
2.1.
HEFESTAEMME
.
14
23.
BAKTERIENSTAEMME
.
15
23.
VEKTOREN
.
15
2.4.
NAEHNNEDIEN
.
17
2.4.1.
NAEHRBODEN-GRUNDSTOFFE
.
17
2.43.
NAEHRMEDIEN
FIIR
E.
COLI
.
18
2.43.
NAEHRMEDIEN
FIIR
S.
CEREVISIAE
.
18
23.
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
.
20
2.6.
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
.
21
2.7.
ENZYME
.
22
2.8.
ANTIKOERPER
.
22
2.9.
OLIGONUKLEOTIDE
.
23
2.10.
PEPTID
.
24
2.11.
RADIOCHEMIKALIEN
.
24
2.12.
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
24
2.13.
GERAETE
.
25
2.14.
VERSCHIEDENES
.
25
3.1.
E.
COTF-KULTUREN
.
26
33.
S.
CEREVISIAE-KNLTWEN
.
26
33.
PRAEPARATION
VON
DNA
.
26
33.1.
ANALYTISCHE
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.
CO/I-ZELLEN
.
26
333.
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.
COLI-ZELLEN
.
27
3.4.
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
VON
DNA
.
27
33.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNGEN
VON
DNA
.
28
33.1.
FRAGMENTIERUNG
VON
DOPPELSTRANG-DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
28
333.
BEHANDLUNG
VON
LINEARISIERTER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
29
333.
AUFFIILLEN
VON
5'-UEBERHAENGENDEN
DNA-ENDEN
.
29
3.6.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
.
30
3.6.1.
ANALYTISCHE UND
PRAEPARATIVE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
30
3.63.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
PRAEPARATIVEN
GELEN
.
31
3.7.
DNA-SEQUENZANALYSE
.
31
33.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-HARNSTOFF-GELELEKTROPHORESE
.
32
3.9.
KLONIERUNG
REKOMBINATER
DNA
IN
E.
COLI
.
33
3.9.1.
LIGATION
VON
DNA-DOPPELSTRANG-FRAGMENTEN
.
33
3.93.
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONS-KOMPETENTER
.
CO/I-ZELLEN
.
34
3.93.
TRANSFORMATION
VON
.
COLI-ZELLEN
.
34
3.9.4.
ELEKTROPORATION
VON
.
CO/I-ZELLEN
.
35
INHALTSVERZEICHNIS
N
3.10.
DNA-AMPLIFIKATION
MIT
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
35
3.11.
HYBRIDISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENER
DNA
MIT
EINER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
.
36
3.11.1.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
TRANSFORMIERTER
BAKTERIENKLONE
.
37
3.11.2.
DNA-TRANSFER
AUS
AGAROSE-GELEN
(SOUTHERN
BLOT)
AUF
MEMBRANEN
.
37
3.11.3.
MARKIERUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
.
38
3.11.4.
HYBRIDISIERUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
MIT
MEMBRANGEBUNDENER
DNA
.
38
3.12.
METHODEN
ZUR
HEFEGENETIK
.
39
3.12.1.
KLASSISCHE
TRANSFORMATION
VON
HEFEZELLEN
.
39
3.123.
ELEKTROPORATION
VON
S.
CEREVISIAE
.
40
3.12.3.
PLASMIDISOLATION
AUS
S.
CEREVISIAE
.
40
3.12.4.
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
HEFE-DNA
.
40
3.12.5.
KREUZUNG
VON
HEFEZELLEN
.
41
3.12.6.
SPORUIATION
VON
HEFEZELLEN
.
42
3.12.7.
ANALYSE
VON
HEFETETRADEN
.
42
3.12.8.
BESTIMMUNG
DES
WACHSTUMS
VON
HEFEZELLEN
AUF
AGARPLATTEN
.
43
3.12.9.
ERSTELLEN
VON WACHSTUMSKURVEN
IN
FLUESSIGMEDIUM
.
43
3.13.
ISOLIERUNG
VON
PROTEINEN
.
44
3.13.1.
PRAEPARATION
VON
ROHEXTRAKTEN
AUS
HEFEZELLEN
.
44
3.13.2.
ALKALISCHER
AUFSCHLUSS
VON
HEFEZELLEN
.
44
3.133.
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
45
3.13.4.
MESSUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
.
47
3.14.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOETPER
.
47
3.14.1.
KOPPELUNG
DES
PEPTIDS
AN
OVALBUMIN
.
47
3.143.
IMMUNISIERUNG
DER
KANINCHEN
.
47
3.15.
AFFINITAETSREINIGUNG
POLYKLONALER
ANTIKOETPER
.
48
3.15.1.
ANTIGEN-KOPPELUNG
AN
SEPHAROSE
4B
.
48
3.153.
FAELLUNG
DES
ANTIKOERPERS
.
49
3.153.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
49
3.16.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE-FILTERN
(IMMUNOBLOT-VERFAHREN)
.
50
3.16.1.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE-FILTER
.
50
3.163.
PONCEAU-FAERBUNG
VON
NITROZELLULOSE-FILTERN
.
50
3.16.3.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
PROTEINE
AUF
NITROZELLULOSE-FILTERN
.
5
1
3.17.
IMMUNPRAEZIPITATION
SPEZIFISCHER
PROTEINE
.
51
3.17.1.
DETERGENZ-EXTRAKTE
AUS
SPHAEROPLASTEN
.
52
3.173.
KOPPELUNG VON ANTIKOERPERN
AN
PROTEIN
G-SEPHAROSE
.
53
3.173.
NICHT-RADIOAKTIVE
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
SPHAEROPLASTEN-EXTRAKTEN
.
53
3.17.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
HEFEZELLEN
.
54
3.173.
IMMUNPRAEZIPITATION
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROTEINE
.
56
3.18.
TCA-PRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
.
57
3.19.
ANALYSE
VON
INVERTASE
DURCH
AKTIVITAETSFAERBUNG
.
57
330.
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
.
59
330.1.
KONSTRUKTION
DER
VEKTOREN
.
60
3303.
TRANSFORMATION
EINER
CDNA-GENBANK
.
60
3303.
X-GAL-FILTER-TEST
.
61
331.
MORPHOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
DER
VAKUOLE
IN
HEFEZELLEN
.
62
4.
ERGEBNISSE.
.
.
63
4.1.
ANALYSE
DES
LOESLICHEN
SLY
12AC-PROTEINS.
63
4.1.1.
DELETION
DER
TRANSMEMBRANDOMAENE
VON
SLYL2P
.
63
4.13.
EXPRESSION
DES
SLY12&C
IN
VERSCHIEDENEN
HEFESTAEMMEN
.
65
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.13.
N-TERMINALE
FUSION
DES
SLY
12P
MIT
DEM
SENDAI-EPITOP
.
68
4.1.4.
BIOLOGISCHE
AKTIVTAET
DER
SENDAI-SLY
1
2-HYBRIDPROTEINE
.
69
4.1.5.
ANALYSE
DES
PHAENOTYPS
DURCH
LICHTMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
71
4.1.6.
EXPRESSIONSKONTROLLE
DER
SENDAI-SLY
1
2-FUSIONSPROTEINE
.
72
4.1.7.
STABILISIERUNG
DER
LOESLICHEN
SLYL2-PROTEINE
.
74
43.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTI-SLY
12P-ANTIKOERPER
.
75
4.2.1.
GEWINNUNG
UND
TEST
DER
PRIMAEREN
ANTISEREN
.
75
4.2.2.
AFFINITAETSREINIGUNG
DER
ANTI-SLY
1
2P-ANTISEREN
.
76
43.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
KOMPONENTEN
DES
FUSIONSKOMPLEXES
.
76
43.1.
KOPPELUNG
DES
ANTIKOERPERS
AN
PROTEIN
G-SEPHAROSE
.
78
433.
HERSTELLUNG
VON
DETERGENZ-PROTEINEXTRAKTEN
AUS
SPHAEROPLASTEN
DES
SEC78-/-MUTANTENSTAMMES
.
78
433.
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
EXTRAKTEN
DES
SEC78-7-MUTANTENSTAMMES
.
79
43.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
EXTRAKTEN
DES
SECI8-7-MUTANTENSTAMMES,
DER
EIN
PERMANENT
MEMBRANGEBUNDENES
YPTLP
EXPREMIERT
.
81
433.
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
EXTRAKTEN
DES
THERMOSENSITIVEN
SEC79-7-MUTANTENSTAMMES
.
82
4.4.
HERSTELLUNG
EINER
YPTL
^-MUTANTE
.
90
4.4.1.
MUTAGENESE
DES
YPTL-GENS
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
90
4.43.
INTEGRATION
VON
YPTL
A67L
IN
DAS
GENOM
DER
BAECKERHEFE
.
91
4.43.
UEBERPRUEFUNG
DER
ORTSSPEZIFISCHEN
INTEGRATION
DES
YPTF^-ALLELS
IN
DAS
GENOM
VON
S.
CEREVISIAE
DURCH
YYSOUTHERN
BLOT
"
-ANALYSE
.
93
4.4.4.
VERIFIKATION
DES
KAELTESENSITIVEN
PHAENOTYPS
DER
YPRF^-MUTANTE
.
95
43.
DURCHMUSTERUNG
EINER
GENBANK
MIT
DEM
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
.
96
43.1.
KONSTRUKTION
DER
ZWEI-HYBRID-SYSTEM-VEKTOREN
.
96
433.
KONTROLLE
DER
EXPRESSION
DER
GAIA
TP77-HYBRID-GENE
.
98
433.
TRANSFORMATION
MIT
DER
PAD-GA4-CDNA-GENBANK
.
100
4.6.
CHARAKTERISIERUNG
DES
MYPF-GENS
.
102
4.6.1.
SEQUENZDATEN UND ANALYSE
DES
AUS
DER
NUKLEOTIDSEQUENZ
ABGELEITETEN
MYP1
-GENPRODUKTES
.
102
4.63.
ISOLIERUNG
DES
VOLLSTAENDIGEN
M
YPF-GENS
.
108
4.63.
UNTERBRECHUNG
DES
MYPL-GENS
.
109
4.6.4.
UNTERSUCHUNG
DES
WACHSTUMSVERHALTENS
DES
AMYPF-STAMMES
.
111
4.63.
UNTERSUCHUNG
DER
SEKRETION
VON
INVERTASE
IM
AMYPF-STAMM
.
111
4.6.6.
ANALYSE
DES
INTRAZELLULAEREN
TRANSPORTES
DER
CARBOXYPEPTIDASE
Y
IM
M
TPF-DELETIONSSTAMM
.
113
4.6.7.
FUSION
DES
MYPLP
MIT
DEM
C-MYC-EPITOP
.
114
4.6.8.
UNTERSUCHUNG
DER
SPEZIFITAET
DER
INTERAKTION
DES
MYPL-PROTEINS
MIT
YPTL
N121I
P
UND
YPTL
067
^
.
116
4.6.9.
UNTERSUCHUNG
ZUR
SUPPRESSION
VON
WACHSTUMSDEFEKTEN
VERSCHIEDENER
SEKRETIONSMUTANTEN
DURCH
UEBEREXPRESSION
DES
MYPL-GENS
.
119
5.
DISKUSSION.
_
.
122
5.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
SLY
12-PROTEINS
UND
SEINER
SPEZIFISCHEN
FUNKTION
IM
VESIKULAEREN
TRANSPORT
ZWISCHEN
ER
UND
GOLGI-KOMPARTIMENT
.
122
53.
DER
KAELTESENSITIVE
PHAENOTYP
DER
YPTL
^^-MUTANTE
.
127
53.
IDENTIFIZIERUNG
DES
MYPLP
ALS
INTERAGIERENDES
PROTEIN
VON
YPTL
N,2,,
P
UND
YPTL
Q6,L
P
.
129
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
.135
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
137
8.
LITERATURVERZEICHNIS.
-
.
.
-
.
-
-
.
.
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