Funktionelle Analyse des Regulatorproteins pUL69 des menschlichen Cytomegalovirus:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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INHALTSVERZEICHNIS
A)
ZUSAMMENFASSUNG
.
3
B)
EINLEITUNG
.
4
C)
MATERIAL
UND
METHODEN
.
9
1.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
9
1.1.
BAKTERIEN
.
9
1.2.
HEFE
.
9
1.3.
SAEUGER-ZELLEN
.
9
1.4.
VIRUSSTAEMME
.
9
1.5.
SEREN
UND
ANTIKOERPER
.
10
2.
NUKLEINSAEUREN
.
11
2.1.
OLIGONUKLEOTIDE
.
11
2.2.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
11
2.3.
CDNA-GENBANKEN
.
16
2.4.
SONSTIGE
NUKLEINSAEUREN
.
16
3.
ENZYME
UND
MEDIEN
.
16
3.1.
ENZYME
.
16
3.2.
MEDIEN
.
16
3.3.
STANDARD-PUFFERLOESUNGEN
.
18
4.
STANDARDMETHODEN
UND
REAGENZSYSTEME
.
18
5.
ZELLKULTURVERFAHREN
.
19
6.
INFEKTIONEN
UND
PLAQUE-REINIGUNG
.
20
6.1.
INFEKTION
UND
PASSAGE
VON
HCMV
.
20
6.2.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
VIREN
.
20
6.3.
PLAQUE-REINIGUNG
.
20
7.
ANALYSE
VON
VIRUSPARTIKELN
.
21
7.1.
REINIGUNG
VON
VIRUSPARTIKELN
.
21
7.2.
DETERGENSBEHANDLUNG
VON
VIRUSPARTIKELN
.
21
8.
TRANSFEKTIONEN
UND
LUZIFERASE-MESSUNGEN
.
22
8.1.
TRANSFEKTIONEN
MIT
CALCIUM-PHOSPHAT
.
22
8.2.
ELEKTROPORATION
.
22
8.3.
LUCIFERASE-MESSUNGEN
.
23
9.
DNA-METHODEN
.
23
9.1.
DELETIONSMUTAGENESE
.
23
9.2.
DNA-HYBRIDISIERUNG
.
24
9.3.
PCR-REAKTIONEN
.
24
10.
RNASE-PROTEKTIONSANALYSE
.
25
11.
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
PROTEINEN
.
26
11.1.
REINIGUNG
VON
HIS-FUSIONSPROTEINEN
AUS
E.
COLI
.
26
11.2.
REINIGUNG
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
AUS
E.
COLI
.
27
11.3.
GELELEKTROPHORESE
UND
FAERBUNG
.
28
12.
IMMUNOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
.
28
12.1.
IMMUNOBLOT
.
28
12.2.
IMMUNOPRAEZIPITATION
.
29
12.3.
IMMUNOFLUORESZENZ
UND
KONFOKALE
MIKROSKOPIE
.
30
13.
INTERAKTIONSKLONIERUNG
IN
HEFE
.
31
13.1.
TRANSFORMATION
.
31
13.2.
FILTER-TEST
.
32
13.3.
ONPG-TEST
.
32
13.4.
ISOLATION
VON
DNA
AUS
HEFE
.
33
13.5.
ZELLAUFSCHLUSS
ZUM
PROTEINNACHWEIS
.
34
13.6.
DURCHFUEHRUNG
DER
INTERAKTIONSKLONIERUNG
.
34
14.
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEIN/PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
.
35
14.1.
GST-AFFINITAETSPRAEZIPITATIONEN
.
35
14.2.
KO-IMMUNOPRAEZIPITATION
.
35
15.
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
.
36
15.1.
NACHWEIS
VON
NEOMYCIN-PHOSPHOTRANSFERASE
AKTIVITAET
.
36
15.2.
DNA-ISOLATION
FUER
PCR
UND
SOUTHERN-BLOT
.
37
D)
ERGEBNISSE
.
38
1.
PUL69
ALS
BESTANDTEIL
VON
VIRUSPARTIKELN
.
38
1.1.
NACHWEIS
EINER
SUBFORM
VON
PUL69
IN
VIRUSPARTIKELN
.
38
1.2.
LOKALISIERUNG
VON
PUL69
IM
TEGUMENT
DER
VIRUSPARTIKEL
.
40
1.3.
ANALYSE
DES
PHOSPHORYLIERUNGSZUSTANDS
VON
PUL69
.
42
1.4.
AKTIVIERUNG
DES
HAUPT-IE-ENHANCERS
DURCH
UL69
UND
KOOPERATIVER
EFFEKT
MIT
PP7
1
.
44
2.
ANALYSE
DER
AKTIVIERENDEN
EIGENSCHAFTEN
VON
PUL69
.
47
2.1.
EINFLUSS
VON
PUL69
AUF
HOMOLOGE
UND
HETEROLOGE
PROMOTOREN
.
47
2.2.
EINFLUSS
VON
PUL69
AUF
DIE
MRNA-MENGE
.
48
2.3.
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
.
50
2.4.
TRANSAKTIVIERENDE
EIGENSCHAFTEN
DER
UL69-DELETIONSMUTANTEN
.
53
2.5.
PUL69
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
SPLEISSEN
UND
POLYADENYLIERUNGSSIGNALE
.
55
3.
WECHSELWIRKUNG
VON
PUL69
MIT
ZELLULAEREN
FAKTOREN
.
58
3.1.
IDENTIFIZIERUNG
VON
ZELLULAEREN
INTERAKTIONSPARTNEM
VON
PUL69
.
58
3.2.
BESCHREIBUNG
DER
INTERAKTIONSPARTNER
.
63
3.3.
ANALYSE
DER
WECHSELWIRKUNG
IN
VITRO
.
67
3.4.
ANALYSE
DER
WECHSELWIRKUNG
IN
VIVO
.
69
4.
HERSTELLUNG
EINES
REKOMBINANTEN
VIRUS
MIT
DELETION
DES
UL69-LESERAHMENS
.
72
4.1.
KONSTRUKTION
EINES
REKOMBINATIONSVEKTORS
.
72
4.2.
HERSTELLUNG
EINES
REKOMBINANTEN
VIRUS
MIT
DELETION
DES
UL69
LESERAHMENS
.
74
E)
DISKUSSION
.
77
F)
LITERATURVERZEICHNIS
.
85
G)
ABKUERZUNGEN
.
99 |
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