Die molekularbiologische und biochemische Charakterisierung der Enoyl-[ACP]-Reduktase aus Cuphea lanceolata:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
V
1.
EINLEITUNG
1.1
MASSGESCHNEIDERTE
OELE
UND
FETTE
1
1.2
DIE
NOVO-FETTSAEUREBIOSYNTHESE
4
1.3
DIE
SPEICHERLIPIDSYNTHESE
8
1.4
REGULATION
DER
FETTSAEUREBIOSYNTHESE
IN
PFLANZEN
10
1.5
ISOFORMEN
IN
DER
FETTSAEUREBIOSYNTHESE
11
1.6
DIE
ENOYL-[ACP]
REDUKTASE
(EAR)
12
1.7
DIE
ACYL-[ACP]
THIOESTERASE
(TE,
FAT)
14
1.8
ZIELSETZUNG
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
15
2.
MATERIAL
2.1
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
SONSTIGES
16
2.2
KULTURMEDIEN
16
2.2.1
BAKTERIENMEDIEN
16
2.2.2
PFLANZENMEDIEN
17
2.3
BAKTERIENSTAEMME,
BAKTERIOPHAGEN
17
2.4
PLASMIDE
18
2.5
LISTE
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTIDE
18
2.6
GENOMISCHE
BANK
VON
CUPHEA
LANCEOLATA
19
2.7
PFLANZENMATERIAL
19
3.
METHODEN
3.1
ENZYMATISCHE
DNA-MODIFIKATIONEN
20
3.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
20
3.3
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
20
3.4
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
21
3.5
ARBEITEN
MIT
KOMPETENTEN
E.
COLI-ZELLEN
21
3.5.1
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
.
COLI-ZELLEN
21
3.5.2
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
CO/I-ZELLEN
UND
DEREN
TRANSFORMATION
21
3.6
HERSTELLUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
HYBRIDISIERUNGSONDEN
21
3.7
AUFIEINIGUNG
SPEZIFISCHER
X-KLONE
AUS
DNA-BANKEN
22
3.8
PRAEPARATION
VON
1-PHAGEN
DNA
22
INHALTSVERZEICHNIS
3.9
SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
23
3.10
EXOHI/MUNG
BEAN-NUKLEASE
DELETIONEN
23
3.11
DNA-SEQUENZIERUNG
23
3.12
ISOLATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
BRASSICA
NAPUS
UND
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
24
3.13
ARBEITEN
MIT
RNA
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
25
3.13.1
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
25
3.13.2
AUFREINIGUNG
VON
POLY(A)
+
RNA
25
3.13.3
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
26
3.14
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR,
POLYMERASE
CHAIN
REACTION)
26
3.15
SCHNELLE
VERVIELFAELTIGUNG
VON
CDNA-ENDEN
(RACE,
RAPID
AMPLIFICATION
OF
28
CDNAENDS)
3.15.1
5'-RACE
28
3.15.2
3-RACE
28
3.16
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
29
3.17
VEKTORKONSTRUKTIONEN
29
3.17.1
KONSTRUKTION
DER
BINAEREN
VEKTOREN
PROCLEARG5,
PROCLEARG7
UND
29
PROCLEARG20
3.17.2
KONSTRUKTION
DES
BINAEREN
VEKTORS
EN4-CLEARG20-PREL
30
3.17.3
KONSTRUKTION
DER
BINAEREN
VEKTOREN
EN4-FATB3
UND
EN4-FATB4
30
3.18
HERSTELLUNG
TRANSGENER
PFLANZEN
30
3.18.1
KONJUGATION
VON
BAKTERIEN
30
3.18.2
PLASMID-DNA-PRAEPARATION
AUS
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
31
3.18.3
TRANSFORMATION
VON
BRASSICA
NAPUS
31
3.19
TRANSIENTE
TRANSFORMATION
VON
PROTOPLASTEN
31
3.19.1
ISOLATION
VON
MESOPHYLLPROTOPLASTEN
AUS
TABAK
31
3.19.2
TRANSFORMATION
VON
TABAKPROTOPLASTEN
32
3.19.3
PROTOPLASTENERNTE
32
3.20
FLUORIMETRISCHEJ3-GLUKURONIDASE
(GUS)-ANALYSE
33
3.21
HISTOLOGISCHER
J8-GLUKURONIDASE
(GUS)-NACHWEIS
33
3.22
ANFERTIGEN
VON
DUENNSCHNITTEN
34
3.23
FETTSAEUREANALYTIK
34
3.23.1
AUFBEREITUNG
VON
VERESTERTEN
FETTSAEUREN
34
3.23.2
ANZUCHT
VON
BAKTERIENKULTUREN
ZUR
ANALYSE
DER
GESAMTFETTSAEUREN
35
3.23.3
AUFBEREITUNG
DER
GESAMTFETTSAEUREN
AUS
BAKTERIENKULTUREN
35
3.23.4
GASCHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSE
35
3.24
PROTEINISOLATION
AUS
PFLANZENGEWEBEN
FUER
SDS-PAGE
36
3.25
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
36
3.26
SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
36
3.27
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLAU
37
3.28
PRAEPARATIVE
AUFREINIGUNG
VON
POLYHISTIDIN-FUSIONSPROTEINEN
37
3.29
ERZEUGUNG
VON
ANTISERUM
GEGEN
DAS
ENOYL-[ACP]
REDUKTASE-FUSIONSPROTEIN
38
3.30
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
38
3.31
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
FILTERGEBUNDENER
PROTEINE
38
INHALTSVERZEICHNIS
3.32
PROTEINISOLATION
AUS
BLATTGEWEBE
FUER
2D-PAGE
39
3.33
ZWEIDIMENSIONALE
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
39
3.34
EAR-AKTIVITAETSMESSUNGEN
39
4.
ERGEBNISSE
4.1
ISOLATION
UND
KARTIERUNG
VON
GENOMISCHEN
ENOYL-[ACP]
REDUKTASE
(EAR)
KLONEN
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
41
4.2
SEQUENZANALYSE
DER
EAR-GENE
44
4.3
DIE
ARCHITEKTUR
DER
EAR-GENE
50
4.4
KLASSIFIZIERUNG
DER
ISOLIERTEN
EAR-GENE
UND
IHRER
PRODUKTE
52
4.5
DIE
TERTIAERSTRUKTUR
DER
EARS
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
55
4.6
NORTHERN-BLOT-ANALYSEN
MIT
TYPSPEZIFISCHEN
SONDEN
60
4.7
DIE
PROMOTOREN
DER
EAR-GENE
62
4.8
UNTERSUCHUNG
DES
EAR-EXPRESSIONSMUSTERS
ANHAND
VON
PROMOTOR-UIDA
FUSIONEN
64
4.8.1
KONSTRUKTION
VON
BINAEREN
EXPRESSIONSVEKTOREN
ZUR
STEUERUNG
DER
SS
GLUKURONIDASE-GENEXPRESSION
DURCH
EAR-PROMOTOREN
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
64
4.8.2
TRANSFORMATION
VON
RAPS
MIT
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
66
4.8.3
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
VON
TRANSGENEN
RAPSPFLANZEN
66
4.8.4
FLUORIMETRISCHE
ANALYSE
DER
EAR-PROMOTORAKTIVITAET
IN
TRANSGENEM
RAPS
67
4.8.5
HISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
AKTIVITAET
DES
PROMOTORS
PROCLEARG20
IN
TRANSGENEM
RAPS
70
4.9
INDUZIERBARKEIT
DES
PROMOTORS
PROCLEARG20
DURCH
DAS
PHYTOHONNON
ABSCISINSAEURE
76
4.10
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
NEGATIVEN
REGULATION
DES
PROMOTORS
PROCLEARG20
77
4.11
EXPRESSION
DER
EARS
VOM
TYP
A
UND
C
ALS
6XHIS-FUSIONSPROTEIN
IN
E.
COLI
79
4.12
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEN
EARS
AUS
E.
COLI
80
4.13
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
GEGEN
DIE
EAR
81
4.14
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
DREI
EAR-ISOFORMEN
IM
BLATTGEWEBE
VON
CUPHEA
LANCEOLATA
83
4.15
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
EARS
VOM
TYP
A
UND
C
84
4.15.1
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
85
4.15.2
HEMMUNG
DER
EARS
DURCH
ACYL-ACPS
UND
CI
8:1
86
4.16
KOMPLEMENTATION
DER
ENVM-E.
COZI-MUTANTE
DURCH
DIE
EAR-ISOZYME
A
UND
C
92
4.17
COEXPRESSION
VON
EAR
TYP
A
UND
C
MIT
FATB3
IN
E.
COLI
93
4.18
EXPRESSION
EINER
EAR
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
IN
BRASSICA
NAPUS
99
4.19
EXPRESSION
VON
FATB3
UND
FATB4
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
IN
BRASSICA
NAPUS
102
5.
DISKUSSION
5.1
DIE
STRUKTUR
DER
EAR-GENE
108
5.2
DIE
EAR-ISOFORMEN
A,
B
UND
C
110
INHALTSVERZEICHNIS
5.3
DIE
TERTIAERSTRUKTUR
DER
EAR
111
5.4
DIE
TRANSKRIPTIONALE
REGULATION
DER
EAR
112
5.4.1
DAS
EXPRESSIONSMUSTER
DER
EAR
113
5.4.2
INDUZIERBARKEIT
DES
EAR
(TYP
A)-PROMOTORS
DURCH
ABSCISINSAEURE
117
5.4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
NEGATIVEN
REGULATION
DES
EAR
(TYP
A)-PROMOTORS
119
5.5
FEEDBACK-REGULATION
DER
EAR
120
5.6
DIE
FUNKTION
DER
EAR-ISOFONNEN
IN
CUPHEA
LANCEOLATA
124
5.7
EXPRESSION
PFLANZLICHER
FETTSAEUREBIOSYNTHESE-ENZYME
IN
E.
COLI
126
5.8
EXPRESSION
VON
FETTSAEUREBIOSYNTHESE-ENZYMEN
AUS
CUPHEA
LANCEOLATA
IN
BRASSICA
NAPUS
129
6.
ZUSAMMENFASSUNG
133
7.
LITERATURVERZEICHNIS
135
8.
ANHANG
VEROEFFENTLICHUNGEN
VON
TEILEN
DER
VORLIEGENDEN
DISSERTATION
DANKSAGUNG
ERKLAERUNG
LEBENSLAUF |
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