Entwicklung eines Systems zur direkten Markierung von Nukleinsäuren mit Enzym-Reporter-Molekülen zur sensitiven Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäure-Target-Molekülen:
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1997
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INHALT
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN IV
FORMELZEICHEN VI
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG
1
1.1 EINLEITUNG
\
1.2 PROBLEMSTELLUNG 2
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN UND STAND DER LITERATUR 4
2.1 METHODEN ZUM NACHWEIS VON NUKLEINSAEUREN 4
2.1.1 DIREKTE NACHWEISVERFAHREN 6
2.1.2 INDIREKTE NACHWEISMETHODEN G
2.2 MARKIERUNGEN VON NUKLEINSAEUREN G
2.2.1 ENZYMATISCHE MARKIERUNGEN G
2.2.2 CHEMISCHE MARKIERUNGEN 9
2.2.2.1 DERIVATISIERUNGEN DER ZUCKEREINHEIT 10
2.2.2.2 REAKTIONEN AM PHOSPHATRUECKGRAT 11
2.2.2.3 MODIFIKATIONEN DER BASEN 11
2.3 KOPPLUNGEN VON NUKLEINSAEUREN AN PROTEINE 12
2.4 REPORTERENZYME 15
2.4.1 REPORTERENZYME UND ENZYMSUBSTRATE 15
2.4.2 DAS CEDIA SYSTEM 20
2.5 AMPLIFIKATIONSSYSTEME 22
2.5.1 DIE YYPOLYMERASE CHAIN REACTION" (PCR) 23
3 MATERIALIEN UND METHODEN 25
3.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN, REAGENZIEN UND GERAETE 25
3.2 ELEKTROPHORESEN 27
3.2.1 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE 27
3.2.2 POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 28
3.2.3 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 29
3.3 OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE 30
3.4 KOPPLUNG VON PROTEINEN AN OLIGONUKLEOTIDE 31
3.4.1 AKTIVIERUNG DER OLIGONUKLEOTIDE 31
3.4.2 KOPPLUNG VON LUCIFERASE AN AKTIVIERTE OLIGONUKLEOTIDE 32
3.4.3 KOPPLUNG VON ALKALISCHER PHOSPHATASE AN AKTIVIERTE OLIGONUKLEOTIDE
33
3.4.4 KOPPLUNG DES ENZYMDONORS AN AKTIVIERTE OLIGONUKLEOTIDE 34
3.5. HPLC-REINIGUNG DER ENZYMDONOR-OLIGONUKLEOTID KONJUGATE 34
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/952339226
INHALT
3.6 PROTEINBESTIMMUNG 35
3.7 AKTIVITAETSTESTS DER ENZYME 3 5
3.7.1 AKTIVITAETSBESTIMMUNG VON LUCIFERASE 35
3.7.2 AKTIVITAETSBESTIMMUNG VON ALKALISCHER PHOSPHATASE 36
3.7.3 AKTIVITAETSBESTIMMUNG VON NATIVER UND KOMPLETTIERTER
SS-GALACTOSIDASE 36
3.8 STABILITAETSTESTS DER ENZYME 37
3.8.1 STABILITAET DER LUCIFERASE 3 7
3.8.2 STABILITAET VON ALKALISCHER PHOSPHATASE 38
3.8.3 STABILITAET DES ENZYMDONORS IN VERSCHIEDENEN PUFFERN 38
3.9 FRAGMENTIERUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSVERDAUUNG 38
3.10 YYPOLYMERASE CHAIN REACTION" (PCR) 39
3.10.1 PCR ZUR VERVIELFAELTIGUNG VON FRAGMENTEN DER M13MPL8-DNA 39
3.10.2 PCR ZUR VERVIELFAELTIGUNG VON FRAGMENTEN GENOMISCHER HUMAN-DNA 41
3.11 MUTAGENESE VON M13MP 18 PLASMID DNA 43
3.12 UEBERTRAGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN AUF MEMBRANEN 45
3.13 NICHTRADIOAKTIVE DETEKTION VON NUKLEINSAEUREN 46
3.13.1 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION AUF NYLONMEMBRANEN 46
3.13.2 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION IN MIKROTITERPLATTEN 48
3.13.3 HYBRIDISIERUNG IN POLYSTYROLROEHRCHEN 49
4. ERGEBNISSE 50
4.1 AKTIVIERUNG DER OLIGONUKLEOTIDE 50
4.2 KOPPLUNG DER AKTIVIERTEN OLIGONUKLEOTIDE AN REPORTERENZYME 52
4.2.1 KOPPLUNG VON LUCIFERASE AN AKTIVIERTE OLIGONUKLEOTIDE 53
4.2.2 KOPPLUNG VON ALKALISCHER PHOSPHATASE AN AKTIVIERTE OLIGONUKLEOTIDE
55
4.2.3 KOPPLUNG DES ENZYMDONORS AN AKTIVIERTE OLIGONUKLEOTIDE ' 56
4.3 STABILITAET UND AKTIVITAET DER ENZYME UND IHRER KONJUGATE 58
4.3.1 LUCIFERASE
58
4.3.2 ALKALISCHE PHOSPHATASE 59
4.3.3 STABILITAET UND KOMPLETTIERUNG DES ENZYMDONORS 60
4.4 PCR ZUR SYNTHESE DER HYBRIDISIERUNGSTEMPLATES 65
4.5 EINFUEHRUNG VON PUNKTMUTATIONEN IN DIE ML 3MPL 8-DNA 67
4.6 HYBRIDISIERUNGEN MIT ENZYMDONOR-OLIGONUKLEOTID KONJUGATEN 68
4.6.1 HYBRIDISIERUNGEN AN TARGETOLIGONUKLEOTIDE 69
4.6.2 HYBRIDISIERUNGEN AN PCR PRODUKTE 73
4.6.3 DETEKTION VON MUTATIONEN 77
4.6.4 DETEKTIONEN MIT ANDEREN SS-GALACTOSIDASESUBSTRATEN 85
4.7 HYBRIDISIERUNGEN MIT ALKALISCHE PHOSPHATASE-OLIGONUKLEOTID
KONJUGATEN 86
II
INHALT
5 DISKUSSION
5.1 REAKTIONEN DER HETEROBIFUNKTIONALEN LINKER,
OLIGONUKLEOTIDAKTIVIERUNG UND
PROTEINKOPPLUNG
5.2 KONJUGATE DER LUCIFERASE MIT OLIGONUKLEOTIDEN
5.3 KONJUGATE ALKALISCHER PHOSPHATASEN 89
5.4 KONJUGATE DES ENZYMDONORS 91
5.4.1 QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 94
5.4.2 DETEKTION VON MUTATIONEN 95
5.5 VERGLEICHENDE BETRACHTUNGEN 95
5.6 AUSBLICK 97
6 ZUSAMMENFASSUNG 99
7 LITERATURVERZEICHNIS 100
8 ANHANG
III |
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