Die Hsp-70-Gene der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1997
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INHALT
SEITE
1.
EINLEITUNG. !
1.1 GEZIELTER PROTEINTRANSPORT UND MEMBIANTRANSLOKATION.
1
1.2 MOLEKULARE CHAPERONE.
3
1.3 DIE HSP70- UND DNAJ (HSP40)-PROTEINE VON
S.CEREVISIAE. 7
1.4 PEROXISOMEN.
10
1.5 ZIEL DER ARBEIT. 12
2.
MATERIAL UND METHODEN. 13
2.1 STAEMME UND MEDIEN.
13
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME.
13
2.1.2 ECO/Z-MEDIEN UND-ANZUCHT.R:. 13
2.1.3 LAGERUNG DER .CO//-STAEMME. 13
2.1.4 HEFESTAEMME.
13
2.1.5 HEFE-MEDIEN UND-ANZUCHT.
13
2.1.6 LAGERUNG DER HEFESTAEMME.
13
2.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME. 14
2.3 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS. 14-
2.4 PLASMIDE. 14
2.5 OLIGONUKLEOTIDE. 15
2.6 ANTIKOERPER. 16
2.7 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN. 16
2.7.1 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA NACH DER ALKALISCHEN METHODE. 16
2.7.2 PRAEPARATIVE PLASMIDISOLATION UEBER CSCL-GRADIENTEN. 16
2.7.3 PRAEPARATIVE PLASMIDISOLHTION MIT DEM "QUIAGEN PLASMID MIDI KIT".
16
2.7.4 PRAEPARATION VON HEFE-DNA. 16
2.7.5 PRAEPARATION VON HEFE-RNA. 16
2.8 PCR. 16
2.9 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN. 17
2.10 DNA-RESTRIKTION. 17
2.11 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN IN AGAROSEGELEN.
17
2.11.1 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSEGELEN. 17
2.11.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA IN AGAROSEGELEN. 17
2.12 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN. 17
2.13 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-S'-ENDEN. 18
2.14 DNA-LIGATION. 18
2.15 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH "RANDOM PRIMED
LABDING". 18
2.16 ABTRENNUNG VON NUKLEOTIDEN AUS DNA-MARKIERUNGSREAKTIONEN. 18
2.17 SPEZIFISCHER NACHWEIS VON DNA-FRAGMENTEN. 18
2.17.1 SOUTHEM-ANALYSE. 18
2.17.2 .CO/Z'-KOLONIEHYBRIDISIERUNG. 18
2.18 SPEZIFISCHER NACHWEIS VON RNA-FRAGMENTEN DURCH NORTHERN-ANALYSE. 18
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALT
2.19 DNA-SEQUENZIERUNG. 19
2.20 SEQUENZANALYSEN. 19
2.21 AUTORADIOGRAPHIE. 19
2.22 TS-CO/I-TRANSFORMATION. 19
2.22.1 TRANSFORMATION VON
E. COLI NACH DER RBCL-METHODE. 19
2.22.2 TRANSFORMATION VON
E.COLI DURCH ELEKTROPORATION. 19
2.23 HEFE-TRANSFONNATION. 19
2.23.1 TRANSFORMATION GEFRORENER HEFE-ZELLEN. 19
2.23.2 HEFETRANSFORMATION DURCH ELEKTROPORATION. 19
2.24 PRAEPARATION ZELLFREIER HEFE-ROHEXTRAKTE. 19
2.25 PROTEIN-KONZENTRATIONSBE STIMMUNG. 19
2.26 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IN
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN. 20
2.27 IMMUNOLOGISCHER PROTEIN-NACHWEIS DURCH WESTERN-ANALYSE. 20
2.28 PAARUNG VON HEFESTAEMMEN. 20
3.
ERGEBNISSE. 21
3.1 HERSTELLUNG VON HSP70-GENSONDEN. 21
3.2 KLONIERUNG VON HSP70-GENEN AUS EINER GESAMT-GENBANK VON
H.POLYMORPHA. 22
3.2.1 KLONIERUNG DES
HSA 7-GENS. 23
3.2.2 KLONIERUNG DES
HSB-GENS. 25
3.2.3 KLONIERUNG DES
HSC-GEOS. 27
3.2.4 KLONIERUNG EINES TTSD-GENFRAGMENTES. 28
3.3 KLONIERUNG VON HSP70-GENEN AUS PARTIELLEN GENBANKEN VON
H.POLYMORPHA. 29
3.3.1 SOUTHEM-ANALYSE DES
H.POLYMORPHA-GEAOMS ZUR IDENTIFIZIERUNG NICHT MONIERTER
HSP70-FRAGMENTE. 29
3.3.2 KLONIERUNG DES
HSA2-GENS. 31
3.3.3 KLONIERUNG DES
HSD-GENS. 35
3.3.4 KLONIERUNG DES
HSEL-GTNS. 37
3.4 ABSCHLIESSENDE SOUTHERN-ANALYSEN DER HSP70-FAMILIE VON
H.POLYMORPHA. 39
3.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR HSP70-TRANSKRIPTION. 43
3.5.1 UNTERSUCHUNG ZUR HITZESCHOCKINDUZIERBARKEIT DER 77S4-GENE. 43
3.5.2 WACHSTUMSPHASEN- UND KOHLENSTOFFQUELLEN-ABHAENGIGKEIT DER
HSP70-TRANSKRIPTION. 44
3.6 HERSTELLUNG VON HSP70-MUTANTEN. 47
3.6.1 DISRUPTION DES7Z47-GENS. 47
3.6.2 DISRUPTION DES 77&42-GENS. 48
3.7 CHARAKTERISIERUNG DER AHSAL- UND AASA2-MUTANTEN. 50
3.7.1 UNTERSUCHUNG DES WACHSTUMS AUF VERSCHIEDENEN KOHLENSTOFFQUELLEN.
50
3.7.2 UNTERSUCHUNG DER TEMPERATURSENSITIVITAET. 51
3.7.3 UNTERSUCHUNG DER
HSA 7- UND HSA2-TRANSKRIPTION IN DEN AASA-EINZELMUTANTEN. 52
3.8 VERSUCHE ZUR KONSTRUKTION EINER AHSALAASFL2-DOPPELMUTANTE. 53
3.8.1 AHSAL X AHSA2-PAARUNGSVERSUCHE. 53
3.8.2 VERSUCH ZUR KONSTRUKTION EINER KONDITIONAL-LETALEN
A7WA7A/I.SA2-MUTANTE. 54
INHALT
4.
DISKUSSION. 57
4.1 DIE HSP70-FAMILIE VON
H.POTYMORPHA. 57
4.2 UNTERSUCHUNG DER HSP70-TRANSKRIPTION IN H.PCTYMORPHA. 62
4.3 CHARAKTERISIERUNG VON AHSAL- UND AASO2-MUTANTEN. 63
5.
ZUSAMMENFASSUNG. 66
\
6.
LITERATUR. 67
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS. 82 |
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