Charakterisierung von drei isomeren 2,3-Dihydroxybiphenyl-1,2-Dioxygenasen aus Rhodococcus globerulus P6 und ihrer Rolle beim Abbau von polychlorierten Biphenylen (PCB):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Clausthal-Zellerfeld
Papierflieger
1997
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Braunschweig, Techn. Univ., Diss., 1997 |
| Beschreibung: | VI, 182 S. grph. Darst. |
| ISBN: | 3897200589 |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
.
1
1
1
UMWELTSCHADSTOFFE
PCB
.
1
1.1.1
HERSTELLUNG
UND
VERBREITUNG
.
1
1.1.2
VORKOMMEN
UND
TOXIZITAET
.
2
1.2
BAKTERIELLER
PCB-ABBAU
.
3
12.1
EXTRADIOL-DIOXYGENASEN
.
5
1.3
UMSATZ
VON
PCB
DURCH
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
8
1.3.1
DREI ISOMERE
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
WURDEN
IN
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
GEFUNDEN
.
9
1.4
ZIELSETZUNG
DIESER
ARBEIT
.
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
12
2.1
GERAETE
.
12
2.2
CHEMIKALIEN,
BIOCHEMIKALIEN
.
13
2.3
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
.
14
2.4
MEDIEN
UND
PUFFER
.
15
2
5
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
16
2.5.1
ZELLANZUCHT
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLFREIEN
EXTRAKTEN
.
16
2.5
1.1
ESCHERICHIACOLI.
16
2.5.1.2
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6:
.
17
2
5.2
BESTIMMUNG
VON
PROTEINGEHALTEN
.
17
2.5.3
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
.
18
2.5.3.1
BERECHNUNG
DER
KINETISCHEN
PARAMETER
.
19
2
5.3.2
SCHNELLTEST
ZUM
NACHWEIS
DER
ENZYMAKTIVITAT
.
20
2.5.4
ENZYMAUFREINIGUNG
.
20
2.5.4.1
UEBEREXPRESSION
DER2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
.
20
2.5.4.2
AMMONIUMSULFAT-FRAKTIONIERUNG
.
21
2.5.4
3
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
21
2.5.4
4
EINENGEN
VON
PROTEINLOESUNGEN
DURCH
ULTRAFILTRATION
.
23
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.5
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
23
2
5
6
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
DES
NATIVEN
ENZYMS
PER
GELFILTRATION
.
24
2.5
7
ANALYTISCHE
VERFAHREN
.
26
2.5
.7
1
PRAEPARATION
VON
CHLORSUBSTITUIERTEN
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
.
26
2.5
7.2
QUALITATIVE
BESTIMMUNG
DES
UMSATZES
VON
CHLORSUBSTITUIERTEN
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
IM
SPEKTROPHOTOMETER
.
27
2.5
7
3
IDENTIFIZIERUNG
VON
CHLORBENZOATEN
NACH
UMSATZ
VON
CHLORSUBSTITUIERTEN
.
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
MITTELS
HPLC
.
27
2
5.7.4
QUANTITATIVE
MESSUNG
DES
UMSATZES
VON
CHLORSUBSTITUIERTEN
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
IM
SPEKTROPHOTOMETER
.
30
2.6
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
29
2
6.1
ANTIKOERPER
FUER
NACHWEISREAKTIONEN
.
29
2.6.2
WESTERN
BLOT
NACHWEISVERFAHREN
.
29
2.6.3
ELISA
NACHWEISVERFAHREN
.
31
2
6
4
HERSTELLUNG
VON
HYBRIDOM-ZELLLINIEN
ZUR
PRODUKTION
MONOKLONALER
ANTIKOERPER.
.
.31
2.6.4.1
IMMUNISIERUNG
DER
MAUSE
.
31
2
6.4.2
ISOLIERUNG
VON
PERITONEALMAKROPHAGEN
.
32
2
6
4
3
ZELLFUSION
.
32
2.6.4.4
SUBKLONIERUNG
.
33
2
6
5
ISOTYPENBESTIMMUNG
VON
MONOKLONALEN
MAUS-ANTIKOERPEM
.
34
2.6.6
MASSENPRODUKTION
VON
ANTIKOERPERN
IN
ROLLER-KULTUREN
.
34
2.6.7
AUFREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
UEBER
PROTEIN
A-SEPHAROSE
.
35
2
6.8
BIOSENSORMESSUNGEN
MIT
BIACORE
.
35
2.6
8.1
IMMOBILISIERUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
37
2
6.8
2
QUANTIFIZIERUNG
DER
ANTIGENE
.
38
2.7
GENETISCHE
METHODEN
.
39
2.7
1
PRAEPARATION
VON
DNA
.
39
2.7.11
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
39
2
7
12
SCHNELLE
ANALYTISCHE
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
39
2.7.1.3
PRAPARATION
GENOMISCHER
DNA
VON
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
.
39
2.7.1
4
PHENOLEXTRAKTION
VON
DNA
.
40
2
7.2
DNA-GELELEKTROPHORESE
.
40
2
7
3
EXTRAKTION
VON
DNA-BANDEN
AUS
EINEM
AGAROSEGEL
.
40
2.7.4
ENZYMATISCHE
MANIPULATIONEN
VON
DNA
.
41
2
7.4.1
DNA-SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
41
2
7
4
2
HERSTELLUNG
VON
BLUNT-END
DNA-FRAGMENTEN
.
41
2
7.4.3
PHOSPHATASEBEHANDLUNG
.
41
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.4
4
LIGATION
.
42
2.7.5
TRANSFORMATIONEN
.
42
2.7.5
1
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIACOLI
DH5A
.
42
2.7
5.2
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
.
43
2.7.6
PCR-METHODEN
.
44
2.8
MIKROSKOPISCHE
METHODEN
.
45
2.8.1
LICHTMIKROSKOPIE
.
45
2
8.2
TEM
(TRANSMISSIONS
ELEKTRONENMIKROSKOPIE)
.
45
2.8.2.1
TEM
NACH
NEGATIVKONTRASTIERUNG
.
45
2.8.2.2
TEM
NACH
FIXIERUNG
MIT
RUTHENIUM
ROT,
EINBETTUNG
IN
EPOXY-KUNSTHARZ
UND
ULTRAMIKROTOMIE
.
46
2.9
DOKUMENTATION,
DATENVERARBEITUNG
.
47
3
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
.
49
3.1
CHARAKTERISIERUNG
VON
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
49
3.1.1
WACHSTUMSGESCHWINDIGKEIT
UND
ZELLMORPHOLOGIE
VON
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
BEI
VERWERTUNG
VERSCHIEDENER
SUBSTRATE
.
49
3
1.1.1
WACHSTUM
AUF
MINERALAGARPLATTE
MIT
BIPHENYL
.
49
3.1.1.2
WACHSTUM
IN
FLUSSIGKULTUR
MIT
BIPHENYL
.
52
3.1.1.3
WACHSTUM
IN
FLUESSIGEM
KOMPLEXMEDIUM
(LB)
.
53
3.1.1.4
WACHSTUM
IN
FLUSSIGKULTUR
MIT
SUCCINAT,
CITRAT,
FRUKTOSE
UND
BENZOAT
.
54
3.1
1.5
VERGLEICH
DES
WACHSTUMS
VON
P6
MIT
UNTERSCH.
KOHLENSTOFFQUELLEN
.
55
3.1.1.6
WACHSTUM
VON
P6
MIT
BIPHENYL
BEI
UNTERSCHIEDLICHEN
TEMPERATUREN
UND
VERGLEICH
ZU
BURKHOLDERIA
SP.
LB400
.
55
3
1.2
WACHSTUM
MIT
VERSCHIEDENEN
AROMATISCHEN
KOHLENSTOFFQUELLEN
.
57
3
2
AUFREINIGUNG
DER
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
AUS
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
58
3
2.1
AMMONIUMSULFAT-FRAKTIONIERUNG
.
60
3.2.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
(HIC)
.
60
3
2
3
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
61
3.2.4
GELFILTRATION
.
63
3
2
5
REINHEITSUEBERPRUEFIING
DER
ANGEREICHERTEN
ENZYME
.
65
3.2
6
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
AUFREINIGUNG
.
66
3.3
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
DREI
ISOENZYME
.
68
M
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.1
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTS
DER
NATIVEN
ISOENZYME
UND
IHRER
UNTEREINHEITEN
.
68
3
3
3
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
DER
ISOENZYME
.
70
3
3
4
KATALYTISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL
1,2-DIOXYGENASEN
AUS
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
71
3.3.4.1
UMSATZ
VON
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYL
.
72
3
3.4
2
UMSATZ
VON
3-METHYLCATECHOL
.
75
3
3
4
3
UMSATZ
VON
CATECHOL
.
78
3.3.4.4
UMSATZ
VON
4-METHYLCATECHOL
.
81
3.3
.4
5
UMSATZ
VON
3-CHLORCATECHOL
.
84
3.3.4.6
INHIBITION
DURCH
3,4-DIHYDROXYBIPHENYL
.
85
3
3.4.7
VERGLEICH
DER
KATALYTISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DER
DREI
BPHC-ISOENZYME
AUS
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
89
3
3.5
UMSATZ
VON
CHLORSUBSTITUIERTEN
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
DURCH
VERSCHIEDENE
EXTRADIOL-DIOXY
GENASEN
.
91
3.3
5.1
UMSATZ
VON
CHLORSUBSTITUIERTEN
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
DURCH
RUHENDE
ZELLEN
MIT
DEN
DREI
ISOENZYMEN
VON
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
.
94
3
.3
5.2
QUANTITATIVE
UNTERSUCHUNG
DES
UMSATZES
VON
19
CHLORSUBSTITUIERTEN
2,
3-DIHYDROXYBIPHENYLEN
DURCH
VERSCHIEDENE
EXTRADIOL-DIOXYGENASEN
.
99
3
4
EXPRESSION
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
IN
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
105
3
4.1
VERGLEICH
DER
EXPRESSION
DER
DREI
ISOENZYME
DURCH
GELFILTRATION
.
105
3.4
2
HERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
DIE
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
AUS
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
.
108
3
4
2
1
BESTIMMUNG
DES
ISOTYPS
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
111
3.4.2
2
MASSENPRODUKTION
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
AKXHI,
AKXTV
UND
AKXV
IN
ROLLER-ZELLKULTUREN
.
112
3
4.2.3
AUFREINIGUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
113
3.4.2
4
REINHEITSUBERPRUFUNG
DER
AUFGEREINIGTEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
114
3.4
3
VERGLEICH
DER
EXPRESSION
ZWISCHEN
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
WACHSEND
MIT
BIPHENYL
UND
IN
KOMPLEXEM
MEDIUM
(LB)
.
115
3
4.4
ENTWICKLUNG
EINER
METHODE
ZUR
QUANTITATIVEN
EXPRESSIONSUNTERSUCHUNG
VON
PROTEINEN
MITTELS
MONOKLONALER
ANTIKOERPERN
UND
DER
BIACORE-TECHNIK
.
117
3.4
4.1
IMMOBILISIERUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
118
3
4
4.2
KALIBRIERUNG
DES
BIACORE-SYSTEMS
FUER
DIE
MESSUNG
VON
ANTIGEN
KONZENTRATIONEN
.
118
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.5
QUANTITATIVE
EXPRESSIONSUNTERSUCHUNG
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXY
BIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
IN
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
IN
ABHAENGIGKEIT
ZUR
KULTURPHASE
.
119
3.4.6
INDUKTION
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
DURCH
BIPHENYL
BEIM
WACHSTUM
VON
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
MIT
VERSCHIEDENEN
.
SUBSTRATEN
.
123
3.5
MUTAGENESE
VON
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
ZUR
HERSTELLUNG
VON
MUTANTEN
DIE
NUR
EINE
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL
1
,2-DIOXYGENASEN
EXPRIMIEREN
.
127
3
5.1
ANTIBIOTIKA-SENSITIVITAET
VON
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
.
128
3.5.2
STABILITAET
DER
BIPHENYL-ABBAUEIGENSCHAFTEN
VON
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
BEIM
WACHSTUM
MIT
KOMPLEXEM
MEDIUM
(LB)
.
128
3.5.3
ENTWICKLUNG
EINER
TRANSFORMATIONSMETHODE
FUER
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6.
.
129
3.5.4
MUTAGENESE
VON
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
129
3.5.4.1
MUTAGENESE
VON
BPHCL
.
3.5.4.2
MUTAGENESE
VON
BPHC2
.
132
3.5.4.3
MUTAGENESE
VON
BPHC3
.
132
4
DISKUSSION
.
.
134
4.1
BPHC2
UND
BPHC3
-EINE
NEUE
KLASSE
VON
EXTRADIOL-DIOXYGENASEN?
.
134
4.1.1
STRUKTURVERGLEICH
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXY
GENASEN
AUS
P6
MIT
ANDEREN
EXTRADIOL-DIOXYGENASEN
.
135
4.1.2
VERGLEICH
DER
KATALYTISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXY
BIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
AUS
P6
MIT
ANDEREN
EXTRADIOL-DIOXYGENASEN
.
140
4
2
DIE
ROLLE
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL
1
,2-DIOXYGENASEN
AUS
P6
BEIM
ABBAU
VON
PCB
.
146
4.2.1
PCB-ABBAU
DURCH
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
146
4.2.2
UMSATZ
CHLORSUBSTITUIERTER
2,3-DIHYDROXYBIPHENYLE
DURCH
DIE
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
AUS
P6
.
150
4.2.3
INITIALER
ANGRIFF
VERSCHIEDENER
PCB-KONGENERE
DURCH
DIE
BIPHENYL
2,3-DIOXYGENASE
AUS
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
151
4.2.4
EXPRESSION
DER
DREI
ISOMEREN
2,3-DIHYDROXYBIPHENYL-L,2-DIOXYGENASEN
IN
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
.
154
4.2.5
ERWEITERUNG
DES
PCB-UMSATZES
VON
RHODOCOCCUS
GLOBERULUS
P6
DURCH
BPHC2
?
.
158
INHALTSVERZEICHNIS
4.3
RHODOCOCCUSGLOBERULUS
P6
-INTRESSANTE
EIGENSCHAFTEN
EINES
BAKTERIUMS
MIT
GROSSEN
MOEGLICHKEITEN
IM
PCB-ABBAU
.
160
4
4
AUSBLICK
.
162
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
165
6
ABKUERZUNGEN
.
167
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
169
DANKSAGUNGEN
LEBENSLAUF
VI |
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