CREB-CRE-abhängige Steigerung der c-Fos-Gentranskription durch Calcium-mobilisierende Agonisten in pankreatischen beta-Zellen:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
1996
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| Beschreibung: | Göttingen, Univ., Diss., 1996 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
CALCIUM
ALS
INTRAZELLULAERER
YYSECOND
MESSENGER
"
IN
PANKREAS
ZELLEN
1
1.2
DIE
CALCIUMINDUZIERTE
GENTRANSKRIPTION
3
1.2.1
DIE
CALCIUMINDUZIERTE
CREB/CRE-ABHAENGIGE
GEN
TRANSKRIPTION
IN
PANKREASZELLINIEN
3
1.3
DAS
INSULIN
UND
DAS
C-FOS-GEN
ALS
MOEGLICHE
ZIELE
DES
CALCIUMINDUZIERTEN
CREB/CRE-ABHAENGIGEN
SIGNAL
TRANSDUKTIONSWEGS
IN
PANKREAS-SS-ZELLEN
6
1.4
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
7
2
MATERIAL
8
2.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
8
2.2
VERBRAUCHSMATERIAL
9
2.3
GERAETE
UND
MASCHINEN
10
2.4
SOFTWARE
10
2.5
LOESUNGEN
UND
PUFFER
11
2.6
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
17
2.6.1
EUKARYONTEN
17
2.6.2
PROKARYONTEN
17
2.6.3
VERWENDETE PLASMIDE
17
2.6.3.1
KLONIERUNGS
UND
REPORTERGEN-VEKTOREN
18
2.6.3.2
EXPRESSIONSVEKTOREN
18
2.6.3.3
REPORTERGEN-VEKTOREN
MIT
SUBKLONIERTEN
PROMOTOR
FIAGMENTEN
AUS
PANKREASINSELZELLGENEN
19
2.6.3.4
REPORTERGEN-VEKTOREN
MIT
SUBKLONIERTEN
PROMOTOR
FIAGMENTEN
AUS
DEM
HUMANEN
C-FOS-GEN
19
2.6.3.5
PLASMIDE
ALS
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
FUER
DIE
RNA-ANALYSE
20
2.6.4
OLIGONUKLEOTIDE
21
2.6.4.1
SEQUENZIERUNGSPRIMER
21
2.6.5
ANTIKOERPER
21
2.6.6
BAKTERIELLES,
REKOMBINANTES
CREB-PROTEIN
22
2.7
NAEHRMEDIEN
UND
KULTURFUEHRUNG
22
2.7.1
NAEHRMEDIEN
FUER
EUKARYONTISCHE
ZELLKULTUR
22
2.7.2
BAKTERIELLE
NAEHRMEDIEN
22
2.7.3
KULTURFUEHRUNG
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
23
2.7.3.1
ZELLPASSAGE
23
2.7.3.2
EINFRIEREN
UND
AUFRAUEN
VON
ZELLEN
23
2.7.4
KULTURFUEHRUNG
VON
BAKTERIEN
24
2.7.4.1
VERMEHRUNG
VON
E.
CO/I-STAEMMEN
24
2.7.4.2
ANLEGEN
EINER
BAKTERIENSTAMMKULTUR
24
3
STANDARD-METHODEN
25
3.1
AUFREINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
25
3.2
REKOMBINANTE
TECHNIKEN
26
3.2.1
VERMEHRUNG
UND
REINIGUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
BAKTERIENKULTUREN
26
3.2.1.1
CAESIUMCHLORID-MAXI-PLASMID-PRAEPARATION
AUS
E.
COLI
26
3.2.1.2
QIAGEN-PLASMID-PRAEPARATION
AUS
E.
COLI
27
3.2.1.3
MINI-PLASMID-PRAEPARATION
AUS
BAKTERIEN
27
3.2.2
RESTRIKTIONSENZYMATISCHE
SPALTUNG
28
3.2.3
KONZENTRATIONS-UND
REINHEITSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
3.2.4
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
3.2.4.1
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-DNA
29
3.2.4.2
HERSTELLUNG
VON
DOPPELSTRANG-OLIGONUKLEOTIDKETTEN
29
3.2.4.3
PHOSPHORYLIERUNG
VON
INSERT-DNA
29
3.2.4.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
30
3.2.4.4.1
LIGATION
VON
MONOMEREN
30
3.2.4.4.2
LIGATION
VON
OLIGOMEREN
30
3.2.4.5
PRAEPARATION
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
30
3.2.4.6
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
31
3.2.4.7
IDENTIFIZIERUNG
REKOMBINANTER
PLASMIDE
31
3.2.4.8
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
31
3.2.4.9
WIEDERGEWINNUNG
VON
GELELEKTROPHORETISCH
AUFGETRENNTEN
DNA
FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN.
32
3.2.4.10
KLONIERUNG
SPEZIELLER
VEKTOREN
32
3.2.4.10.1
KLONIERUNG
DES
VEKTORS
P-71
IFOSLUC
32
3.2.4.10.2
KLONIERUNG
DES
VEKTORS
P-71
IMFOSLUC
33
3.2.4.10.3
KLONIERUNG
DER
VEKTOREN
4XFOSCRELUC
UND
4XMFOSCRELUC
33
3.2.5
DNA-SEQUENZIERUNG
33
32.5.1.1
DENATURIERUNG
DER
DNA
33
3.2.5.1.2
ANNEALING
DER
PRIMER
34
3.2.5.1.3
MARKIERUNGSREAKTION
34
3.2.5.1.4
TERMINATIONSREAKTION
34
32.5.2
AUFTRENNUNG
DER
SEQUENZANSAETZE
UEBER
EIN
DENATURIERENDES
POLYACRYLAMIDGEL
34
32.5.2.1
PRAEPARATION
DES
SEQUENZGELS
35
32.5.2.2
VORBEHANDLUNG
DER
ELEKTROPHORESEPLATTEN
35
3.2.52.3
GELELEKTROPHORESE
35
3.3
NUKLEINSAEUREANALYTIK
35
3.3.1
ANALYSE
EUKARYONTISCHER
DNA-FRAGMENTE
DURCH
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
IN
ZELLKULTURLINIEN
36
3.3.1.1
VEKTOREN
36
3.3.1.1.1
LUCIFERASE
ALS
REPORTERGEN
36
3.3.1.12
CHLORAMPHENICOL-ACETYL-TRANSFERASE
ALS
REPORTEIGEN
36
3.3.12
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
37
3.3.1.3
PRAEPARATION
DER
ZELLEXTRAKTE
37
3.3.1.3.1
MESSUNG
DER
LUCIFERASE-REPORTERAKTIVITAET
38
3.3.1.32
MESSUNG
DER
CHLORAMPHENICOL-ACETYL-TRANSFERASE
REPORTERAKTIVITAET
38
3.3.2
AUSWERTUNG
DER
TRANSIENTEN
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
38
3.4
METHODEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
EUKARYONTISCHER
RNA
39
3.4.1
PRAEPARATION
GESAMTER
ZELLULAERER
RNA
AUS
ZELLKULTUR
39
3.4.2
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
UND
TRANSFER
VON
RNA
(NORTHERN
BLOT)
39
3.42.1
PRAEPARATION
DES
GELES
40
3.4.22
ELEKTROPHORESE
40
3.4.2.3
VAKUUM-TRANSFER
DER
RNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
40
3.4.2.4
FIXIERUNG
DER
RNA
AUF
DER
NYLONMEMBRAN
40
3.4.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
EINER
DNA-HYBRIDISIERUNGSSONDE
40
3.4.4
ABTRENNUNG
NICHTINKORPORIERTER
NUKLEOTIDE
MIT
DEM
QIAQUICK
NUCLEOTIDE
REMOVAL
KIT
41
3.4.5
NICHTRADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
RNA-SONDEN
DURCH
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
41
3.4.6
HYBRIDISIERUNG
VON
NORTHERN
BLOTS
42
3.4.6.1
HYBRIDISIERUNG
VON
NORTHERN
BLOTS
MIT
NICHT-RADIOAKTIV
MARKIERTEN
RNA-SONDEN
42
3.4.6.1.1
WASCHEN
DER
FILTER
42
3.4.6.1.2
DETEKTION
DES
SIGNALS
43
3.4.6.1.3
HYBRIDISIERUNG
VON
NORTHERN
BLOTS
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDEN
43
3.4.6.1.4
WASCHEN
DER
FILTER
UND
AUTORADIOGRAPHIE
43
3.5
PROTEINANALYTIK
44
3.5.1.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
44
3.5.2
PRAEPARATION
VON
GESAMTZELLEXTRAKTEN
ZUM
IMMUNOLOGISCHEN
NACHWEIS
PHOSPHORYLIERTER
CREB-PROTEINE
44
3.5.3
PRAEPARATION
VON
KEMPROTEINEXTRAKTEN
44
3.5.4
NACHWEIS
VON
DNA-KEMPROTEIN-KOMPLEXEN
DURCH
NICHTDENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(EMSA)
45
3.5.4.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
45
3.5.4.2
ABTRENNUNG
NICHTINKORPORIERTER
NUKLEOTIDE
MIT
DEM
MERMAID
KIT
46
3.5.4.3
PRAEPARATION
DES
POLYACRYLAMIDGELS
46
3.5.4.4
REAKTIONSANSATZ
47
3.5.4.5
NACHWEIS
DER
BETEILIGUNG
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS
CREB
AN
DER
PROTEIN-DNA-BINDUNG
DURCH
VERWENDUNG
EINES
CREB-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERS
47
3.5.5
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
48
3.5.5.1.1
PRAEPARATION
DES
POLYACRYLAMIDGELS
48
3.5.5.1.2
GELELEKTROPHORESE:
48
3.5.5.2
TRANSFER
DER
PROTEINE
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRAN
(WESTERN
TRANSFER)
49
3.5.6
NACHWEIS
VON
PROTEIN/DNA-BINDUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
(SOUTHWESTEM
BLOT)
49
3.5.7
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
CREB-PROTEINES
MIT
DEM
ECL
WESTERN
BLOTTING
ANALYSIS
SYSTEM
(WESTERN
BLOT)
49
4
ERGEBNISSE
51
4.1
STIMULATION
DER
CREB/CRE-ABHAENGIGEN
GENTRANSKRIPTION
DURCH
CALCIUMMOBILISIERENDE
INSULIN-SEKRETAGOGE
IN
HIT-ZELLEN
51
4.1.1
DIE
CALCIUMABHAENGIGKEIT
DER
WIRKUNG
DES
VASOPRESSINS
AUF
DIE
CRE-ABHAENGIGE
TRANSKRIPTION
55
4.1.2
DIE
WIRKUNG
DES
VASOPRESSINS
AUF
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
UND
AKTIVIERUNG
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS
CREB.
57
4.1.3
BETEILIGUNG
DER
PHOSPHATASE
CALCINEURIN
AN
DER
VASOPRESSIN
INDUZIERTEN
CREB/CRE-ABHAENGIGEN
TRANSKRIPTION
59
4.1.4
WIRKUNG
ANDERER
INSULIN-SEKRETAGOGE
AUF
DIE
CRE-ABHAENGIGE
TRANSKRIPTION
63
4.1.5
ZUSAMMENFASSUNG
ZUR
WIRKUNG
CALCIUMMOBILISIERENDER
AGONISTEN
AUF
DIE
CREB/CRE-ABHAENGIGE
GENTRANSKRIPTION
63
4.2
PRUEFUNG
DER
CALCIUMRESPONSIVITAET
DES
INSULINGEN
I
DER
RATTE
63
4.3
CALCIUM
UND
CAMP-ABHAENGIGKEIT
DES
HUMANEN
C-FOS-GENS
IN
INSULIN-PRODUZIERENDEN
PANKREASINSELZELLINIEN
70
4.3.1
CALCIUM
UND
CAMP-ABHAENGIGKEIT
DER
C-FOS-GEN-MRNA
AKKUMULATION
70
4.3.2
WIRKUNG
DER
DURCH
KALIUMCHLORID
AUSGELOESTEN
MEMBRAN
DEPOLARISATION
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
DES
C-FOS-GENS
IN
INSULIN-PRODUZIERENDEN
SSTC3-UND
HIT-ZELLEN
72
4.3.3
DAS
FOSCRE-ELEMENT
IST
AUSREICHEND
ZUR
VERMITTLUNG
VON
CAMP
UND
CALCIUMRESPONSIVITAET
IN
INSULIN-PRODUZIERENDEN
PANKREASZELLINIEN
73
4.3.4
BETEILIGUNG
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS
CREB
AN
DER
FOSCRE
ABHAENGIGEN
TRANSKRIPTION
76
4.3.5
ABHAENGIGKEIT
DER
DURCH
MEMBRANDEPOLARISATION
AUSGELOESTEN
STI
MULATION
DER
C-FOSCRE-VERMITTELTEN
TRANSKRIP
TION
VOM
EINSTROM
EXTRAZELLULAEREN
CALCIUMS
78
4.3.6
BETEILIGUNG
DER
CALCIUM/CALMODULIN-ABHAENGIGEN
KINASE
IV
AN
DER
CALCIUMABHAENGIGEN
FOSCRE-TRANSKRIPTION
78
4.3.7
WIRKUNG
DES
IMMUNSUPPRESSIVUM
CYCLOSPORIN
A
80
4.3.8
KEMPROTEINE
AUS
PANKREASINSELZELLEN
BINDEN
AN
DIE
HUMANE
C-FOSCRE-SEQUENZ
81
4.3.9
NACHWEIS
DER
CREB-BINDUNG
AN
DIE
FOSCRE-SEQUENZ
88
4.3.10
WIRKUNG
PHARMAKOLOGISCHER
INSULIN-SEKRETAGOGE
AUF
DIE
CRE
ABHAENGIGE
TRANSKRIPTION
89
4.3.11
WIRKUNG
VON
VASOPRESSIN
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
VON
IN
SS-ZELLEN
EXPRIMIERTEN
GENEN
90
4.4
WIRKUNG
VON
FOS
UND
JUN-UEBEREXPRESSION
AUF
DIE
INSULINGEN
TRANSKRIPTION
92
4.5
ZUSAMMENFASSUNG
DER
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
C-FOS-GENTRANSKRIPTION
IN
PANKREASINSELZELLINIEN
93
5
DISKUSSION
94
5.1
DIE
STIMULATION
DER
CREB/CRE-ABHAENGIGEN
TRANSKRIPTION
IN
PAN
KREASZELLEN
DURCH
INSULIN-SEKRETAGOGE
94
5.1.1
SYNERGISTISCHE
WIRKUNG
VON
CAMP
UND
DEM
CALCIUM
MOBILISIERENDEN
INSULIN-SEKRETAGOG
VASOPRESSIN
AUF
DIE
CRE-ABHAENGIGE
GENTRANSKRIPTION
96
5.1.2
DIE
BETEILIGUNG
CALCIUM/CALMODULIN-ABHAENGIGER
KINASEN
UND
DER
PHOSPHATASE
CALCINEURIN
AN
DER
DURCH
INSULIN
SEKRETAGOGE
INDUZIERTEN
CREB/CRE-ABHAENGIGEN
TRANSKRIPTION
97
5.1.3
DIE
MOBILISATION
DES
CALCIUMS
DURCH
DIE
INSULIN-SEKRETAGOGE
CARBACHOL
UND
BOMBESIN
99
5.1.4
DIE
CALCIUMABHAENGIGKEIT
DER
DURCH
AVP-STIMULIERTEN
CREB/CRE
TRANSKRIPTION
100
5.1.5
DIE
MOBILISATION
DES
INTRAZELLULAEREN
CALCIUMS
DURCH
GLUKOSE
101
5.2
DIE
RESPONSIVITAET
DER
INSULINGENTRANSKRIPTION
103
5.3
DIE
CALCIUMRESPONSIVITAET
DES
C-FOS-GENS
IN
INSULIN-PRODUZIERENDEN
PANKREASZELLEN
105
5.3.1
DIE
BETEILIGUNG
DES
CRE-OKTAMERS
AN
CALCIUM
UND
CAMP
RESPONSIVITAET
DES
C-FOS-PROMOTORS
107
5.3.2
DAS
FOSCRE-OKTAMER
ALS
CALCIUM
UND
CAMP-RESPONSIVES
ELEMENT
IN
PANKREASINSELZELLINIEN
108
5.3.2.1
DER
SYNERGISTISCHE
EFFEKT
VON
MEMBRANDEPOLARISATION
UND
C
AMP-ERHOEHUNG
AUF
DIE
C-FOSCRE-TRANSKRIPTION
109
5.3.2.2
DIE
ABHAENGIGKEIT
DER
FOSCRE-TRANSKRIPTION
VOM
EMSTROM
EX
TRAZELLULAEREN
CALCIUMS
109
5.3.2.3
DIE
BETEILIGUNG
CALCIUMABHAENGIGER
ENZYME
AN
DER
FOSCRE
TRANSKRIPTION
IN
PANKREASZELLINIEN
110
5.3.3
DIE
BETEILIGUNG
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS
CREB
AN
DER
FOSCRE
ABHAENGIGEN
TRANSKRIPTION
110
5.3.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
ZUR
CALCIUMRESPONSIVITAET
DES
C-FOS-GENS
112
5.3.5
DIE
FUNKTION
DES
C-FOS
IN
PANKREAS-SS-ZELLEN
113
5.3.5.1
DIE
WIRKUNG
VON
VASOPRESSIN
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
VON
SS-ZELLEXPRIMIERTEN
GENEN
114
53.5.2
DIE
WIRKUNG
VON
TOLBUTAMID
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
SS-ZELL
EXPRIMIERTER
GENE
114
5.3.5.3
DER
EFFEKT
VON
C-FOS
UND
C-JUN
AUF
DIE
INSULINTRANSKRIPTION
115
6
ZUSAMMENFASSUNG
116
7
LITERATURVERZEICHNIS
118
8
ANHANG
132
8.1
DANKSAGUNG
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