Verbesserung der Abbauleistung des Bakterienstammes BN6 gegenüber sulfonierten aromatischen Verbindungen: Vergleich zwischen Hybridorganismus und Mischkultur
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1996
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VERBESSERUNG DER ABBAULEISTUNG DES BAKTERIENSTAMMES
BN6 GEGENUEBER SULFONIERTEN AROMATISCHEN VERBINDUNGEN
VERGLEICH ZWISCHEN HYBRTDORGANISMUS UND MISCHKULTUR
VON DER FAKULTAET GEO- UND BIOWISSENSCHAFTEN DER UNIVERSITAET STUTTGART
ZUR ERLANGUNG DER WUERDE EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER.
NAT.) GENEHMIGTE ABHANDLUNG
VORGELEGT VON RAINER RUSS AUS FRANKFURT AM MAIN
HAUPTBERICHTER: PROF. DR. H.-J. KNACKMUSS MITBERICHTER: PROF. DR. C.
SYLDATK TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 07. 11. 1996
INSTITUT FUER MIKROBIOLOGIE DER UNIVERSITAET STUTTGART 1996
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUKZUNGSVEKZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG
2 EINLEITUNG
2.1 AZO&RBSTOFFE
2.2 AROMATISCHE SULFONSAEUREN
2.3 GENTECHNIK IN DER UMWELTMIKROBIOLOEIE
2.4 ZIELSETZUNGEN DER VORLIEGENDEN ARBEIT
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE
8
10
12
13
19
21
26
27
27
3.2 NAEHRLOESUNGEN ( 29
3.2.1 MINERALMEDIUM 29
3.2.2 VITAMINLOESUNG 29
3.2.3 ANTIBIOTIKA- UND AMINOSAEURELOESUNGEN 30
3.2.4 KOMPLEXMEDIEN 30
3.3 STAMMERHALTUNG 30
3.4 ZELLANZUCHTEN 31
3.4.1 ANZUCHT DER MISCHKULTUR AUS STAMM BN6 UND PSEUDOMONAS PUTIDA
NCIB9816 31
3.5 KULTUREN IN BIOREAKTOREN 31
3.5.1 FERMENTERMIT 11 ARBEITSVOLUMEN 31
3.5.2 FERMENTER MIT 41 ARBEITSVOLUMEN 31
3.6 TAXONOMISCHE UNTERSUCHUNGEN 32
3.6.1 GRAM-FAERBUNG 32
3.6.2 KOH-TEST 32
3.6.3 BIOLOG-IDENTIFIZIERUNGSSYSTEM 32
3.7 MESSUNG DES BAKTERIENWACHSTUMS 33
3.8 BIURET-PROTEINBESTIMMUNG MIT GANZEN ZELLEN 33
3.9 TROCKENGEWICHTSBESTIMMUNG 33
3.10 BESTIMMUNG VON D-GLUCOSE 33
3.11 HERSTELLUNG ZELLFREIER EXTRAKTE 34
3.12 PROLEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 34
IMAGE 3
3.13 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 35
3.13.1 1,2-DIHYDROXYNAPHTHALIN-DIOXYGENASE 35
3.13.2 RRANS-2-HYDROXYBENZALPYRUVAT-ALDOLASE 35
3.13.3 SALICYLALDEHYD-DEHYDROGENASE 35
3.13.4 SALICYLSAEURE-1-MONOOXYGENASE _ _ ^_ 36
3.13.5 BRENZCATECHIN-2,3-DIOXYGENASE 36
3.13.6 AMARANTH-REDUKTASE 36
3.13.7 FLAVIN-REDUKTASE 38
3.14 HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE (HPLC) 38
3.15 ENZYMATISCHE PRAEPARATION VON 2-HYDROXYCHROMEN-2-CARBOXYLAT 41
3.16 HERSTELLUNG VON /RAIU-2 -HYDROSYBENZALPYRUVAT 41
3.17 DARSTELLUNG VON 4-HYDROXYIAMINOBENZOAT 42
3.18 UV/VIS-SPEKTROSKOPIE 43
3.19 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 43
3.19.1 PLASMIDPRAEPARATIONEN AUS E.COLI 43
3.19.2 PLASMIDPRAEPARATION UEBER DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 43
3.19.3 ERMITTLUNG DER DNA-KONZENTRATION UND REINHEIT ; 44
3.19.4 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA , - 44
3.19.4.1 SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENZYMEN__J 44
3.19.4.2 KLENOW-ENZYMBEHANDLUNG 45
3.19.4.3 ALKALISCHE PHOSPHATASEBEHANDLUNG 45
3.19.4.4 LIGATION 45
3.19.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 45
3.19.5.1 ELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 46
3.19.6 PRAEZIPITATION VON DNA 46
3.19.6.1 ETHANOLFAELLUNG 46
3.19.6.2 ISOPROPANOLFAELLUNG 46
3.19.6.3 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 46
3.19.7 TRANSFER VON DNA IN ESCHERICHIA COLI 46
3.19.7.1 TRANSFORMATION VON E.COLI JM109 (TSS-METHODE) 47
3.19.7.2 TRANSFORMATION VON E.COLI S17-1 (MOPS-METHODE) 47
3.19.8 FILTERKREUZUNGEN 47
3.20 CHEMIKALIEN UND BIOCBEMIKALIEN 48
4 EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 49
4.1 DIE IDEE DER FLAVIN-REDUKTASE ALS AZOREDUKTASE
4.2 UNTERSUCHUNGEN ZU DEN EIGENSCHAFTEN EINER KLONIERTEN
FLAVIN-REDUKTASE AUS ESCHERICHIA COLI 49
4.2.1 MESSUNG DER SPEZIFISCHEN AKTIVITAET DER FLAVIN-REDUKTASE IN
ZELLFREIEN EXTRAKTEN 49
4.2.2 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN AKTIVITAET ZUR REDUKTION VON AMARANTH
50
4.2.3 DIE FAEHIGKEIT DER FLAVIN-REDUKTASE ZUR REDUKTION AROMATISCHER
NITROVERBINDUNGEN 52
IMAGE 4
43 UEBERTRAGUNG DER FLAVIN-REDUKTASE-AKTIVITAET AUF DEN BAKTERIENSTAMM BN6
53
4.3.1 SUBKLONIERUNG DES FLAVIN-REDUKTASEGENS (FRE) IN DEN
KLONIERUNGSVEKTOR PJOE890 54
4.3.2 SUBKLONIERUNG DES./RE-GENS IN DEN *BROAD HOST RAENGE
EXPRESSIONSVEKTOR PRK415 56
4.3.3 UEBERLEBENSRATE DER ZELLEN DES STAMMES BN6 BEI FILTERKREUZUNGEN 58
4.3.4 OBERTRAGIMG DES PLASMIDS PRJR34 AUF DEN BAKTERIENSTAMM BN6 58
4.3.5 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN AKTIVITAET DER FLAVIN-REDUKTASE IN
ZELLFREIEN EXTRAKTEN
VON BN6 (PRJR34) 60
4.3.6 EINFLUSS VERSCHIEDENER SUBSTRATE AUF DIE AKTIVITAET DER KLONIERTEN
FLAVIN- REDUKTASE IN ROHEXTRAKTEN
DES STAMMES BN6 (PRJR34) 60
4.3.7 BESTIMMUNG DER AZOREDUKTASE-AKTIVITAET MIT AMARANTH ALS SUBSTRAT IN
ZELLFREIEN EXTRAKTEN DES
STAMMES BN6 (PRJR34) 61
4.3.8 WACHSTUMSGESCHWINDIGKEIT DES STAMMES BN6 (PRJR34) 62
4.4 CHEMISCHE REDUKTION VON AALFARBSTOFFEN 63
4.4.1 REDUKTIVE SPALTUNG DER AZOBRUECKE DURCH CHEMISCH REDUZIERTES FAD 63
4.4.2 REDUKTION VON AMARANTH DURCH NADH 65
4.5 AUSWAHL WIRTSCHAFTLICH RELEVANTER AZOFARBSTOFLE 65
4.5.1 BESTIMMUNG DER ABSORPTIONSMAXIMA UND MOLAREN
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN DER UNTERSUCHTEN
AZOFARBSTOFFE ; 68
4.6 REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN DURCH ZELLFREIE EXTRAKTE 69
4.6.1 REDUKTION VERSCHIEDENER AZOFARBSTOFFEN DURCH ZELLFREIE EXTRAKTE
DES STAMMES BN6 69
4.6.2 REDUKTION VERSCHIEDENER AZOFARBSTOFFE DURCH ZELLFREIE EXTRAKTE DES
STAMMES E.COLI K38 (PEELOOL) 70
4.7 REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN DURCH ANAEROBE ZELLSUSPENSIONEN 70
4.7.1 REDUKTION VERSCHIEDENER AZOFARBSTOFFE DURCH ZELLSUSPENSIONEN DES
BAKTERIENSTAMMES BN6 71
4.7.2 REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN DURCH ANDERE BAKTERIENKULTUREN 72
4. 7. 2.1 REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN DURCH ESCHERICHIA COLI 72
4.7.2.2 REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN DURCH EINE TNT-REDUZIERENDE
ANAEROBE MISCHPOPULATION 74
4.7.3 REDUKTION VON AMARANTH ODER MORDANT YELLOW 3 DURCH GANZE ZELLEN
DES STAMMES BN6 (PRJR34) 75
4.7.4 VERSUCHE ZUR STEIGERUNG DER AZOREDUKTIONSRATE DURCH ZUGABE VON
FLAVINEN ODER
DIE ZELLMEMBRAN PERMEABILISIERENDE SUBSTANZEN 76
4.8 DAS VERHALTEN DES STAMMES BN6 UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN 80
4.9 VERSUCHE ZUR AEROBEN REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN DURCH DEN STAMM
BN6 81
4.9.1 VERSUCHE MIT FESTMEDIEN 81
4.9.2 VERSUCHE IN FLUESSIGKULTUR 82
4.10 KONSTRUKTION EINES BN6 HYBRIDSTAMMES MIT DER FAEHIGKEIT ZUR
MINERALISIERUNG VON
NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 83
4.10.1 CHARAKTERISIERUNG DES STAMMES BN6 MITTELS DES BIOLOG
BAKTERIEN-IDENTIFIZIERUNGSSYSTEMS 83 4.10.2 VERSUCHE ZUR UEBERTRAGUNG DER
GENETISCHEN INFORMATION FUER DIE SALICYLATVERWERTUNG AUF DEN
BAKTERIENSTAMM BN6 DURCH IN-VI VO-METHODEN 84
4.10.2.1 KREUZUNGSEXPERIMENTE ZWISCHEN SALICYLAT VERWERTENDEN
BAKTERIENSTAEMMEN UND DEM STAMM BN6 84
4.10.2.2 VERSUCHE DIE MOBILITAET DER NAPHTHALIN PLASMIDE MIT HILFE DES
PLASMIDS RP1 ZU STEIGERN 87
4.10.2.3 KREUZUNGSEXPERIMENTE MIT DREI PARTNERN (TRIPLE MATINGS) 89
IMAGE 5
4.10.2.4 MISCHKULTUREN AUS SALICYLAT VERWERTENDEN BAKTERIENSTAFNMEN UND
DEM STAMM BN6 90
4.10.2.5 KREUZUNGSEXPERIMENTE UND ETABLIERUNG VON MISCHKULTUREN MIT
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SP. G2 UND STAMM BN6 91
4.10.2.6 VERSUCHE ZUR IN VIVO KLONIERUNG DER SAL-GEM MIT HILFE VON
ECM-PLASMIDEN 91
4.10.2.7 ANREICHERUNG SALICYLAT VERWERTENDER BAKTERIEN 92
4.10.2.7.1 TAXONOMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER NEUISOLATE 92
4.10.3 KONSTRUKTION SALICYLAT VERWERTENDER BN6 HYBRIDSTAEMME MIT
GENTECHNISCHEN METHODEN 93
4.10.3.1 KLONIERUNG DER SA/-GENE IN DEN EXPRESSIONSVEKTOR PRK415 93
4.10.3.2 UEBERTRAGUNG DER FAEHIGKEIT ZUM ABBAU VON SALICYLAT AUF DEN STAMM
BN6 95
4.10.3.3 UEBERTRAGUNG DES PLASMIDS PWW60-3026 AUF DEN STAMM BN6 96
4.11 VERGLEICH ZWISCHEN BN6 HYBRIDSTAEMMEN UND NATUERLICHER MISCHKULTUR 97
4.11.1 VERGLEICH DES WACHSTUMS DER MISCHKULTUR UND DER BN6
HYBRIDORGANISMEN 98
4.11.1.1 WACHSTUM MIT NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 98
4.11.1.2 VERAENDERUNG DER VERDOPPLUNGSZEITEN NACH LANGZEITKULTIVIERUNG
MIT NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 99
4.11.1.3 WACHSTUMMIT
VERSCHIEDENENNAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE-KONZENTRATIONEN 100
4.11.1.4 WACHSTUM MIT NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE UND 6-AMINONAPHTHALIN-
2-SULFONSAEURE 101
4.11.2 WACHSTUM VON STAMM BN6 IN GEGENWART VON SALICYLAT 103
4.11.3 STABILITAET DES SALICYLAF-PHAENOTYPS DER BN6 HYBRIDSTAEMMEN UNTER
NICHTSELEKTIVEN BEDINGUNGEN 104
4.11.3.1 WACHSTUM MIT KOMPLEXMEDIUM | 104
4.11.3.2 STABILITAET DES SALICYLAT*-PHAENOTYPS DER BN6 HYBRIDSTAEMMEN BEI
WACHSTUM MIT
6-AMINONAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE_! 107
4.11.4 STABILITAET DER MISCHKULTUR UNTER NICHTSELEKTIVEN BEDINGUNGEN 110
4.11.5 ANTEIL DER STAEMME BN6 UND PS. PUTIDA NCIB9816 AN DER MISCHKULTUR
WAEHREND DES
WACHSTUMS MIT NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 111
4.11.6 SUBSTRATUMSAETZE MIT RUHEZELLEN DES BN6 WILDTYPS, DER BN6
HYBRIDSTAEMME SOWIE DER
MISCHKULTUR AUS STAMM BN6 UND PS.P. NCIB9816 113
4.11.6.1 UMSATZ VON NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 113
4.11.6.2 UMSATZ SUBSTITUIERTER NAPHTHALIN-2-SULFONSAEUREN 115
4.11.7 ENZYMAKTIVITAETEN IN ZELLFREIEN EXTRAKTEN DES BN6 WILDTYPS, DER
BN6 HYBRIDSTAEMME SOWIE DER
MISCHKULTUR AUS STAMM BN6 UND PS.P. NCIB9816 121
4.11.8 VERSUCHE IN KONTINUIERLICHER KULTUR 122
4.11.8.1 WACHSTUM DES STAMMES BN6 (PWW60-3026) IN KONTINUIERLICHER
KULTUR MIT
NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 123
4.11.8.2 WACHSTUM DER MISCHKULTUR AUS STAMM BN6 UND PS.P. NC1B9816 IN
KONTINUIERLICHER KULTUR
MIT NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 125
4.11.8.3 FEDBATCH EXPERIMENTE MIT BN6 (PWW60-3026) 127
4.11.8.4 DIREKTE KOMPETITION ZWISCHEN BN6 (PWW60-3026) UND DER
MISCHKULTUR UNTER
KONTINUIERLICHEN BEDINGUNGEN 129
5 DISKUSSION 134
5.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN 134
5.1.1 REDUKTION VON AZOFARBSTOFFEN MIT HILFE EINER MONIERTEN
FLAVIN-REDUKTASE 134
5.1.1.1 VERGLEICH DER UNTER VERSCHIEDENEN BEDINGUNGEN GEMESSENEN
FLAVIN-UND AZOREDUKTASEAKTIVITAETEN _ 135
IMAGE 6
5.1.1.2 RELEVANZ DER HOCHEXPRIMIERTEN FLAVIN-REDUKTASE FUER DIE IN VIVO
REDUKTION VON
AZOFARBSTOFFEN DURCH DEN BAKTERIENSTAMM BN6 137
5.1.2 DIE REDUKTION WIRTSCHAFTLICH RELEVANTER AZOFARBSTOFFE 139
5.1.2.1 EIGENSCHAFTEN DES KOMPLEXFARBSTOFFS ACID BLACK 52 142
5.2 VERGLEICH ZWISCHEN HYBRIDORGANISMUS UND MISCHKULTUR 143
5.2.1 DIE UEBERTRAGUNG VON PLASMIDEN AUF DEN BAKTERIENSTAMM BN6 143
5.2.2 DIE STABILITAET DES SALICYLAT +-PHAENOTYPS IN DEN BN6 HYBRIDSTAEMMEN
144
5.2.3 VERGLEICH ZWISCHEN MISCHKULTUR UND HYBRIDSTAMM IN ABSATZWEISER
KULTUR 146
5.2.3.1 DER UMSATZ SUBSTITUIERTER NAPHTHALIN-2-SULFONSAEUREN DURCH
RUHEZELLEN 146
5.2.3.2 WACHSTUM MIT NAPHTHALIN-2-SULFONSAEURE 147
5.2.3.3 WACHSTUM MIT SUBSTITUIERTEN NAPHTHALIN-2-SULFONSAEUREN 147
5.2.3.4 MORPHOLOGIE DER MISCHKULTUR AUS STAMM BN6 UND PSEUDOMONAS PUTIDA
NCIB9816 148
5.2.4 VERGLEICH ZWISCHEN MISCHPOPULATION UND HYBRIDSTAMM BEI
KONTINUIERLICHER KULTIVIERUNG 149
5.2.5 BETRACHTUNGEN ZUM MIKROBIELLEN WACHSTUM IN ABSATZWEISER ODER
KONTINUIERLICHER KULTUR 151
5.2.6 KOMPETITION ZWISCHEN HYBRIDORGANISMEN UND MISCHKULTUREN 154
5.2.7 KOMPETITION ZWISCHEN EINEM BN6 HYBRIDSTAMM UND DER MISCHKULTUR AUS
STAMM BN6 UND
PS.PUTIDASCM9S 6 155
5.2.8 ABSCHLIESSENDE UEBERLEGUNGEN . 164
6 LITERATURVERZEICHNIS [ 165
7. ANHANG 180
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