Biochemische und genetische Aufklärung der Biosynthese von Benzoxazinonen in Zea mays:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DIE
BEDEUTUNG
DER
BENZOXAZLNONE
1
1.2.
GRUNDLAGEN
DER
DIMBOA-BIOSYNTHESE
2
1.3.
CYTOCHROM-P450-ENZYME
4
1.4.
KEIMLINGSSPEZIFISCHE
P450-GENE
IN
MAIS
7
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1.
CHEMIKALIEN
UND
HILFSMITTE)
9
2.2.
PFLANZENMATERIAL
9
2.2.1.
VERWENDETE
MAISLINIEN
9
2.2.2.
AUFZUCHT
VON
MAISPFLANZEN
10
2.2.3.
ANZUCHT
VON
ROGGENKEIMLINGEN
10
2.3.
KULTIVIERUNG VON
HEFE
UND
E.CO/AZELLEN
10
2.3.1.
E.CO/ASTAEMME
UND
-PLASMIDE
10
2.3.2.
ANZUCHT
UND
INDUKTION
VON
E.CO/F(BL21)-ZELLEN
10
2.3.3.
HEFESTAEMME
UND
-VEKTOREN
11
2.3.4.
ANZUCHT
UND
INDUKTION
VON
HEFEZELLEN
11
2.4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
11
2.4.1.
DNA-ISOLIERUNG
11
2.4.2.
PCR
12
2.4.2.
SEQUENZIERUNG
12
2.4.3.
SOUTHERN-ANALYSE
ZUR
ANALYSE
MOEGLICHER
MU-INSERTIONSMUTANTEN
12
2.4.4.
ISOLIERUNG
VON
POLY-A+-RNA
AUS
MAISKEIMLINGEN
UND
NORTHERN
13
BLOT
2.4.5.
DNA-KLONIERUNGSTECHNIKEN
13
2.4.6.
KLONIERUNG
VON
BX2,
BX3
UND
BX5
IN
PET3A
13
2.5.
PROTEINBIOCHEMISCHE
TECHNIKEN
14
2.5.1.
PRAEPARATION
VON
PFLANZENMIKROSOMEN
14
2.5.2.
PRAEPARATION
VON
HEFEMIKROSOMEN
14
2.5.3.
PRAEPARATION
VON
UNLOESLICHEN
PROTEINEN
AUS
E.COLI
15
2.5.4.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
15
2.5.5.
ANTIKOERPER
15
2.5.6.
WESTEMBLOT
16
2.5.7.
P450-ENZYMTESTS
16
2.5.8.
BESTIMMUNG
DER
P450-REDUKTASE-AKTIVITAET
16
2.5.9.
CO-DIFFERENZSPEKTROSKOPIE
17
2.5.10.
WEITERE
BIOCHEMISCHE
METHODEN
17
2.6.
NATURSTOFFANATYSEN
17
2.6.1.
EISENCHLORID-FAERBETEST
17
2.6.2.
ISOLIERUNG
VON
ETOAC-LOESLICHEN
NATURSTOFFEN
AUS
KEIMLINGEN
17
2.6.3.
HPLC
18
2.6.4. REDUKTION
VON
DIBOA
ZU
HBOA
18
2.6.5.
ISOLIERUNG
VON
3-HYDROXY-LNDOLIN-2-ON
18
2.6.6.
NMR
19
2.6.7.
GC-MS
19
3.
ERGEBNISSE
20
3.1.
DER
URSPRUNG
DES
KOHLENSTOFFGERUESTS
VON
DIMBOA:
NMR
20
UNTERSUCHUNGEN
MIT
[U
13
C6]-GLUCOSE
3.2.
DER
BIOSYNTHETISCHE
URSPRUNG
DER
SAUERSTOFFATOME
DES
DIMBOA:
22
NMR-UNTERSUCHUNGEN
MIT
18
OA
3.3.
P450-REAKTIONEN
IM
MAISKEIMLING
25
3.3.1.
AKTIVITAET
VON
P450-REDUKTASE
UND
BEKANNTEN
P450-REAKTIONEN
IM
25
MAISKEIMLING
3.3.2.
ANSATZ
ZUR
REINIGUNG
DER
HBOA-N-HYDROXYLASE
AUS
26
MAISMIKROSOMEN
3.4.
EXPRESSION
DER
KEIMLINGSSPEZIFISCHEN
P450-GENE
BX2-5
IN
E.COLL
27
ZUR
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
3.4.1.
KLONIERUNG
VON
BX2,
BX3
UND
BX5
IN
E.CO/AEXPRESSIONSVEKTOREN
28
3.4.2.
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
28
3.4.3.
REINIGUNG
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
29
3.4.4.
NACHWEIS
DER
P450-PROTEINE
BX2-5
IN
MAISMIKROSOMEN
DURCH
30
SPEZIFISCHE
ANTIKOERPER
3.5.
AUFKLAERUNG
DER
GENFUNKTIONEN
DURCH
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
31
HEFE
3.5.1.
REDUKTASEAKTIVITAET
DER
HEFEMIKROSOMEN
31
3.5.2.
QUANTIFIZIERUNG
DER
HEFEEXPRIMIERTEN
P450-ENZYME
32
3.5.3.
BX2-ENZYMAKTIVITAET
IN
VITRO
33
3.5.4.
BX3-ENZYMAKTIVITAET
IN
VITRO
34
3.5.5.
BX4-ENZYMAKTIVITAET
IN
VITRO
34
3.5.6.
BX5-ENZYMAKTIVITAET
IN
VITRO
35
3.5.7.
EINDEUTIGE
ZUORDNUNG
DER
PRODUKTE
DER
ENZYMREAKTIONEN
36
3.5.8.
DIE
BIOSYNTHESE
VON
DIBOA
AUS
INDOL
38
3.6.
DIE
P450-REAKTIONEN
DER
DIBOA-BIOSYNTHESE
IN
PFLANZEN
39
MLKROSOMEN
3.6.1.
DIBOA-BIOSYNTHESE
IN
MAISKEIMLINGEN
39
3.6.2.
SPEZIFISCHE
ENZYMHEMMUNG
DURCH
ANTIKOERPER
41
3.6.3.
DIBOA-BIOSYNTHESE
IN
ROGGENKEIMLINGEN
42
3.6.4.
UNTERSUCHUNG
DER
INDUZIERBARKEIT
DER
GENE
BX2-5
DURCH
42
NAPHTHYLSAEUREANHYDRID
3.7.
FN-VFVO-EINBAUEXPERIMENTE
MIT
SPEZIFISCHEN
DIMBOA-VORSTUFEN
43
3.7.1.
DIE
SYNTHESE
VON
DIMBOA
AUS
INDOL:
KOMPLEMENTATION
DES
43
BXF-PHAENOTYPS
DURCH
[3
13
C]-LNDOL
3.7.2.
KOMPLEMENTATION
DER
BXL-MUTANTE
MIT
WEITEREN
POSTULIERTEN
44
INTERMEDIATEN
DER
DIMBOA-BIOSYNTHESE
3.8.
ISOLIERUNG
VON
MUTANTEN
DER
P450-FAMILIE
BX2-5
46
3.8.1.
TUSC-VERSUCHSANSATZ
47
3.8.2.
ERGEBNIS
DES
MUTANTENSCREENS
47
3.8.3.
IDENTIFIZIERUNG
UND
ANALYSE
EINES
MUTANTEN
ALLELS VON
BX3
50
3.8.4.
PHAENOTYP
DER
HOMOZYGOTEN
INSERTIONSMUTANTE
BX3/BX3
50
3.9.
MODIFIKATION
VON
XENOBIOTIKA
AM
BEISPIEL
VON
P-CHLOR-METHYL
51
ANILIN
(PCMA)
3.9.1.
PCMA-DEMETHYLASEAKTIVITAET
IN
MAISKEIMLINGEN
52
3.9.2.
PCMA-DEMETHYLASEAKTIVITAET VON
BX2-5
52
4.
DISKUSSION
53
4.1.
AUFKLAERUNG
DER
HERKUNFT
DES
DIMBOA-MOLEKUELS
53
4.2.
IDENTIFIZIERUNG
VON
VIER
P450-ENZYMEN
DER
DIMBOA-BIOSYNTHESE
54
DURCH
HETEROLOGE
EXPRESSION
4.3. DIE
DIMBOA-BIOSYNTHESE
IN
VIVO
58
4.4.
SPEZIFITAET
DER
P450-ENZYME
BX2-5
61
4.5.
DIE
EVOLUTION
DES
DIMBOA-STOFFWECHSELS
IM
MAIS
63
4.6.
AUSBLICK
66
5.
ZUSAMMENFASSUNG
67
6.
LITERATURVERZEICHNIS
68 |
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