Verkleinerung des Enzyms Creatinase aus Pseudomonas putida: Modellierung, Herstellung und Untersuchung von Proteinvarianten
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
PRINZIPIEN
DER
STRUKTUR
VON
PROTEINEN
.
1
1.2
PROTEIN-ENGINEERING
UND
PROTEIN-DESIGN
.
3
1.2.1
ERLAEUTERUNG
DER
BEGRIFFE
.
3
1.2.2
ZU
WELCHEM
ZWECK
WERDEN
PROTEIN-ENGINEERING
UND
PROTEIN
DESIGN
EINGESETZT?
.
6
1.2.3
DIE
ROLLE
VON
DELETIONEN
BEIM
ENGINEERING
UND
DESIGN
VON
PROTEINEN
.
7
1.3
HINTERGRUENDE
ZUM
ENZYM
CREATINASE
.
9
1.3.1
ALLGEMEINE
INFORMATIONEN
.
9
1.3.2
STRUKTUR
UND
REAKTIONSMECHANISMUS
.
10
1.4
DAS
ZIEL
DER
ARBEIT
.
16
2.
MATERIALIEN
.
19
2.1
COMPUTER
UND
COMPUTERPROGRAMME
.
19
2.1.1
COMPUTER
.
19
2.1.2
COMPUTERPROGRAMME
.
19
2.2
LABORGERAETE
UND
-MATERIALIEN
.
23
2.3
CHEMIKALIEN
.
25
2.4
PROTEINE
.
25
IV
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.1
PROTEINE
.
25
2.4.2
PROTEINSTANDARDMARKER
.
25
2.4.3
ANTIKOERPER
.
26
2.4.4
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
26
2.5
DNA
.
26
2.5.1
PLASMIDE
.
26
2.5.2
DNA-LAENGENMARKER
.
26
2.5.3
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
2.6
AGAROSE
.
27
2.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
KITS
.
27
2.8
BAKTERIENSTAEMME
.
27
2.9
MEDIEN
UND
ANTIBIOTIKA
.
28
3.
METHODEN
-
THEORETISCHER
TEIL
.
29
3.1
PROTEINSTRUKTURVORHERSAGE
.
29
3.1.1
AUFBAU
EINER
PROTEINFRAGMENT-DATENBANK
.
29
3.1.2
DATENBANKSUCHE
UND
STRUKTURVORHERSAGE
.
33
3.2
PLANUNG
UND
MODELLIERUNG
DER
CREATINASEVARIANTEN
.
35
3.2.1
TOPOLOGIE
UND
KRAFTFELDPARAMETER
VON
CARBAMOYLSARCOSIN
.
.
35
3.2.2
PLANUNG
UND
MODELLIERUNG
EINZELNER
DELETIONEN
.
35
3.2.3
PLANUNG
UND
MODELLIERUNG
VON
KOMBINATIONSVARIANTEN
.
36
3.2.4
PLANUNG
UND
MODELLIERUNG
EINER
MONOMEREN
CREATINASEVARIANTE
36
3.2.5
PLANUNG
UND
MODELLIERUNG
EINER
UM
50
PROZENT
VERKLEINERTEN
CREATINASEVARIANTE
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.
METHODEN
-
PRAKTISCHER
TEIL
.
39
4.1
KULTIVIERUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
.
39
4.1.1
VORKULTUREN
UND
KULTUREN
KLEINEREN
MAFISTABS
.
39
4.1.2
KULTUREN
MITTLEREN
MASSSTABS
.
39
4.1.3
KULTUREN
FUER
DIE
PROTEINAUFREINIGUNG
.
39
4.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
40
4.2.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
40
4.2.2
DNA-PRAEPARATIONEN
IM
MIDI-MASSSTAB
.
42
4.2.3
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
VON
DNA
LOESUNGEN
.
42
4.2.4
VERDAU
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
43
4.2.5
LIGATION
VON
DNA
.
43
4.2.6
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
44
4.2.7
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
45
4.2.8
KINASIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
45
4.2.9
ZIELGERICHTETE
MUTAGENESE
.
46
4.2.10
DNA-SEQUENZIERUNG
.
51
4.2.11
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
53
4.2.12
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
.
54
4.3
PROTEINAUFREINIGUNG
.
55
4.3.1
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
.
55
4.3.2
ZELLAUFSCHLUSS
.
55
4.3.3
AUFREINIGUNG
VON
PROTEINEN
.
56
4.3.4
AUFKONZENTRIEREN
UND
ENTSALZEN
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
58
4.4
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
58
VI
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.1
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
VON
PROTE
INLOESUNGEN
58
4.4.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
59
4.5
IMMUNBIOLOGISCHE
METHODEN
.
60
4.5.1
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
.
60
4.5.2
WESTERN-BLOT
.
61
4.6
ENZYMTESTS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
CREATINASEAKTIVITAET
.
62
4.6.1
PLATTENTEST
.
62
4.6.2
KINETIKTEST
.
64
4.6.3
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
.
65
4.6.4
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-KONSTANTE
.
65
4.6.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
THERMOSTABILITAET
.
66
5.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
-
THEORETISCHER
TEIL
.
67
5.1
PROTEINSTRUKTURVORHERSAGE
.
67
5.2
STRUKTURMODELLE
DER
GEPLANTEN
CREATINASEVARIANTEN
.
67
5.2.1
TOPOLOGIE
UND
KRAFTFELDPARAMETER
VON
CARBAMOYLSARCOSIN
.
.
67
5.2.2
EINZELNE
DELETIONEN
.
68
5.2.3
KOMBINATIONSVARIANTEN
.
72
5.2.4
MONOMERISIERUNG
DER
CREATINASE
.
73
5.2.5
VERKLEINERUNG
DER
CREATINASE
UM
50
PROZENT
.
75
6.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
-
PRAKTISCHER
TEIL
.
79
6.1
EXPRESSIONSSYSTEME
.
79
6.1.1
DIE
PLASMIDE
PBT2A-L
UND
PBT2A-N
.
79
6.1.2
DAS
PLASMID
PKK223-3
.
79
IHHALTAVERZEIDMIS
VII
6.2
HERSTELLUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
DELETIONSVARIANTEN
.
81
6.2.1
VARIANTE
ML
.
83
6.2.2
VARIANTE
M2
.
84
6.2.3
VARIANTE
M4
.
84
6.2.4
VARIANTE
M5
.
85
6.2.5
VARIANTE
M7
.
86
6.2.6
VARIANTE
M47
.
86
6.3
AUFREINIGUNG
DES
CREATINASE-WILDTYPS
.
87
6.4
FEHLER
BEI
DER
HETEROLOGEN
PROTEINEXPRESSION
.
87
6.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
CREATINASEVARIANTEN
.
89
6.6
DIE
THERMISCHE
STABILITAET
DER
VARIANTEN
IM
VERGLEICH
ZUM
WILDTYP
.
.
91
7.
IST
DIE
THERMISCHE
INSTABILITAET
VON
VARIANTE
M4
THEORETISCH
VORHER
SAGBAR?
.
93
8.
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
.
101
LITERATURVERZEICHNIS
.
105
ANHANG
115
A.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
117
B.
TOPOLOGIE
UND
KRAFTFELDPARAMETER
VON
CARBAMOYLSARCOSIN
.
121
C.
OLIGONUKLEOTIDE
.
123
C.L
PRIMER
FUER
DIE
PCR-MUTAGENESE
.123
C.1.1
MUTAGENESEPRIMER
.123
VIII
INHALTSVMEICHBUE
C.1.2
AEUSSERE
PRIMER
.124
C.2
PRIMER
FUER
DIE
DNA-SEQUENZIERUNG
.124
C.3
PRIMER
FUER
DIE
KLONIERUNG
DES
GENS
DER
CREATINASE
.
125
D.
STEUERPARAMETER
FUER
SIMULATIONEN
MIT
AMBER
.
127
D.L
ENERGIEMINIMIERUNGEN
MIT
AMBER
3.1
.127
D.2
MD-SIMULATIONEN
MIT
AMBER
3.1
.
127
D.3
ENERGIEMINIMIERUNGEN
IM
VAKUUM
MIT
AMBER
4.1
.128
D.4
MD-SIMULATIONEN
IM
VAKUUM
MIT
AMBER
4.1
.
129
D.5
ENERGIEMINIMIERUNGEN
IN
WASSER
MIT
AMBER
4.1
.129
D.6
MD-SIMULATIONEN
IN
WASSER
MIT
AMBER
4.1
.129
E.
EIN
UND
DREIBUCHSTABEN-CODE
FUER
AMINOSAEUREN
.
135
F.
GENETISCHER
CODE
.
137
INDEX
.
139 |
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