Quantitativer Nachweis von löslichem Fibrin und Fibrin-Fibrinogen-Komplexen im Plasma: Entwicklung eines neuen Fibrin-ELISA
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VI
1. EINLEITUNG 1
1.1 FUNKTIONEN DES BLUTES 1
1.2 HAEMOSTASE 1
1.3 DIE GERINNUNGSKASKADE 2
1.3.1 DER INTRINSISCHE WEG 4
1.3.2 DER EXTRINSISCHE WEG 4
1.3.3 DIE GEMEINSAME ENDSTRECKE 5
1.4 DIE THROMBOZYTEN 6
1.5 DAS ENDOTHEL 8
1.6 DAS ANTIKOAGULATORISCHE SYSTEM 10
1.6.1 ANTAGONISTEN DER PLASMATISCHEN GERINNUNG 10
1.6.2 DIE FIBRINOLYSE 11
1.6.2.1 PLASMIN 11
1.6.2.2 DIE PLASMINOGEN-AKTIVATOREN 12
1.6.2.3 DIE INHIBITOREN DER FIBRINOLYSE 13
1.6.2.4 DIE FIBRINOLYSE-SPALTPRODUKTE 13
1.7 FIBRINOGEN 15
1.8 FIBRIN 18
1.8.1 F IBRIN-POLYMERISATION 19
1.8.2 FIBRIN-FIBRINOGEN-KOMPLEXE UND LOESLICHE FIBRINE 21
1.9 ZIELSETZUNG 23
2. MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 CHEMIKALIEN UND GERAETE 25
2.1.1 CHEMIKALIEN 25
2.1.2 GERAETE 26
2.2 METHODEN 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.2.1 PLASMA-UND SERUMGEWINNUNG 28
2.2.2 FIBRINOGEN-AUSFAELLUNG 29
2.2.3 ENTWICKLUNG EINES FIBRIN-ELISA 30
2.2.3.1 SANDWICH-ELISA 30
2.2.3.2 FIBRIN-SANDWICH-ELISA 31
2.2.3.3 FIBRIN-ELISA MIT EINEM FIBRINSPEZIFISCHEN UND EINEM
FIBRINOGENSPEZIFISCHEN ANTIKOERPER 32
2.2.3.4 FIBRIN-ELISA MIT ZWEI FIBRINSPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN 32
2.2.3.5 BIOTINYLIEREN EINES FIBRINSPEZIFISCHEN ANTIKOERPERS 32
2.2.3.6 SPEZIFIZIERUNG DES FIBRIN-ELISA 33
2.2.4 DARSTELLUNG EINES FIBRINSTANDARDS 34
2.2.4.1 PHOTOMETRISCHE QUANTIFIZIERUNG DES FIBRINSTANDARDS 34
2.2.4.2 COA-SET FIBRINMONOMER-TESTKIT 35
2.2.4.3 REVERSED PHASE-HPLC-CHROMATOGRAPHIE DER
FIBRINOPEPTIDE A UND B 36
2.2.4.4 V ERGLEICH DES F IBRINSTANDARDS MIT THROMBIN-BEHANDELTEM
STANDARD-HUMAN-PLASMA 37
2.2.5 DURCHFUEHRUNG DES FIBRIN-ELISA 37
2.2.6 KREUZREAKTIONEN MIT FIBRINOLYSE-SPALTPRODUKTEN 38
2.2.7 FIBRINOGEN-ELISA 39
2.2.8 GELFILTRATION 40
I
2.2.8.1 ISOLIERUNG VON FIBRIN-FIBRIN(OGEN)-01IGOMEREN AUS
FIBRINOGEN DURCH SEPHACRYL-3 OO-GELFILTRATION 40
2.2.8.2 ISOLIERUNG VON FIBRIN-FIBRIN(OGEN)-01IGOMEREN AUS
FIBRINOGEN DURCH HPLC-GELFILTRATION 41
2.2.8.3 KONZENTRIERUNG DER HPLC-FRAKTIONEN DURCH
ETHANOL-FAELLUNG 41
2.2.9 ELEKTROPHORESE UND WESTEM-BLOTTING 42
2.2.9.1 SDS-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 42
2.2.9.2 HERSTELLUNG DER AGAROSE-GELE 42
2.2.9.3 DURCHFUEHRUNG DER AGAROSE-SDS-GELELEKTROPHORESE 43
2.2.9.4 WESTEM-BLOTTING DER AGAROSE-GELE 43
INHALTSVERZEICHNIS
III
22
.
9.5
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE) MIT DEM
PHASTSYSTEM 44
22
.
9.6
GELELEKTROPHORESE (PAGE) REDUZIERTER PROTEINPROBEN 44
22
.
9.1
WESTEM-BLOT DER SDS-PAGE-GELELEKTROPHORESE 45
2.2.9.8 ANFARBEN DER PROTEINE AUF DER NITROCELLULOSEMEMBRAN 45
3. ERGEBNISSE 46
3.1 SPEZIFIZIERUNG DES ANTI-FIBRIN-ANTIKOERPERS 46
3.2 ANALYSE DES FIBRINSTANDARDS DURCH ELEKTROPHORESE 47
3.2.1 COOMASSIE BLUE-FAERBUNG 47
3.2.2 WESTEM-BLOT MIT EINEM ANTI-FIBRINOGEN-ANTIKOERPER 48
3.2.3 WESTEM-BLOT MIT EINEM ANTI-FPA-ANTIKOERPER 49
3.2.4 WESTEM-BLOT MIT EINEM ANTI-FIBRIN-ANTIKOERPER 50
3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUM NACHWEIS VON FIBRINOGEN(FIBRIN)-01IGOMEREN
IM PLASMA J UNGER PROBANDEN 51
3.3.1 LASERDENSITOMETRISCHE AUSWERTUNG DES WESTEM-BLOTS 52
3.4 VERGLEICH DER SENSITIVITAET ZWISCHEN EINEM ELISA MIT ZWEI ANTI-
FIBRIN-ANTIKOERPERN UND EINEM ELISA MIT EINEM ANTI-FIBRIN- UND
EINEM ANTI-FIBRINOGEN-ANTIKOERPER 53
3.4.1 SPEZIFIZIERUNG DES ELISA MIT EINEM ANTI-FIBRIN-ANTIKOERPER
UND EINEM ANTI-FIBRINOGEN-ANTIKOERPER 54
3.5 QUANTIFIZIERUNG UND ANALYSE DES FIBRINSTANDARDS 55
3.5.1 UV-PHOTOMETRISCHE MESSUNGEN 55
3.5.2 UNTERSUCHUNG DES FIBRINSTANDARDS MIT DEM COASET-FIBRIN-TEST 56
3.5.3 VERGLEICH DER PROTEINKONZENTRATION DES FIBRINSTANDARDS MIT
THROMBIN-BEHANDELTEM STANDARD-HUMAN-PLASMA IM ELISA-
TESTSYSTEM 2 57
3.5.4 REVERSED PHASE-C 18-CHROMATOGRAPHIE DER
FIBRINOPEPTIDE A UND B 58
3.5.4.1 KALIBRATIONSKURVE DER FIBRINOPEPTID A UND B-
BESTIMMUNG DURCH REVERSED PHASE-CHROMATOGRAPHIE 59
3.6 ABTRENNUNG DER OLIGOMERE AUS PLASMA-FIBRINOGEN DURCH
SEPHACRYL 300-GELFILTRATION 60
INHALTSVERZEICHNIS.
3.7 ABTRENNUNG DER OLIGOMERE AUS PLASMA-FIBRINOGEN DURCH HPLC-
GELFILTRATION MIT EINER GFC-1000 NUCLEOGELSAEULE 61
3.7.1 FIBRIN-ELISA DER FRAKTIONEN 62
3.7.2 ANALYSE DER EINZELNEN FRAKTIONEN DER HPLC-GELFILTRATION
DURCH GELELEKTROPHORESE 63
3.8 HPLC-GELFILTRATION VON KABI-FIBRINOGEN MIT EINER GFC-1000
NUCLEOGELSAEULE 64
3.8.1 FIBRIN-ELISA DER FRAKTIONEN 65
3.9 HPLC-GELFILTRATION DES FIBRINSTANDARDS MIT EINER GFC-1000
NUCLEOGELSAEULE 66
3.9.1 FIBRIN-ELISA DER FRAKTIONEN 67
3.10 TEST DES FIBRIN-ELISA AUF KREUZREAKTIONEN MIT FIBRINOLYSE-
SPALTPRODUKTEN 68
3.10.1 INKUBATION DES FIBRINSTANDARDS MIT PLASMIN 68
3.10.2 INKUBATION VON PLASMA MIT TPA 69
3.11 WIEDERFINDUNG DES FIBRINSTANDARDS IM PLASMA UND SERUM IM
VERGLEICH ZUM FIBRIN IN PUFFERLOESUNG 70
3.11.1 EINFLUSS DES ANTIAGGREGATIONSPEPTIDS -GPRP- (AP) AUF DIE
WIEDERFINDUNGSRATE DES FIBRINSTANDARDS IM PLASMA UND SERUM 71
3.11.2 AUSWIRKUNG DER VERDUENNUNG DES PLASMAS AUF DIE
WIEDERFINDUNGSRATE DES FIBRINSTANDARDS 73
3.11.3 AUSWIRKUNG DER VERDUENNUNG DES SERUMS AUF DIE
WIEDERFINDUNGSRATE DES FIBRINSTANDARDS 74
3.11.4 HPLC-GELFILTRATION VON SERUM MIT EINER GFC-1000
NUCLEOGELSAEULE 75
3.11.5 HPLC-GELFILTRATION VON SERUM MIT EINER GFC-1000
NUCLEOGELSAEULE 76
3.11.5.1 ANALYSE DER FRAKTIONEN DURCH EINEN FIBRIN- UND
FIBRINOGEN-ELISA 77
3.11.6 VERHALTEN DES ELISA BEI ZUGABE VON FIBRONEKTIN ZUM
FIBRINSTANDARD 78
INHALTSVERZEICHNIS
.
4. DISKUSSION 79
4.1 ENTWICKLUNG DES FIBRIN-ELISA 79
4.2 ANALYSE DES FIBRINSTANDANIS 82
4.3 MASKIERUNG DES FIBRINSTANDARDS 83
4.4 FIBRIN-FIBRINOGEN-KOMPLEXE 84
4.5 ABSCHLIESSENDE UEBERLEGUNGEN 86
5. ZUSAMMENFASSUNG 87
6. LITERATURVERZEICHNIS 88 |
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