Etablierung von Zellkulturmodellen der Blut-Hirn- und Blut-Liquor-Schranke zur Untersuchung des Lipoproteintransportes über die cerebralen Barrieren in vitro:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1. VORWORT UND PROBLEMSTELLUNG
.1
2. EINLEITUNG
.3
2.1. DAS ZENTRALE NERVENSYSTEM.V.3
2.2. CEREBRALE SCHRANKENSYSTEME.5
2.2.1. DIE BLUT-HIM-SCHRANKE (BHS).6
2.2.2. DIE BLUT-LIQUOR-SCHRANKE.10
2.3. LIPOPROTEINE.15
2.3.1. LDL-STOFFWECHSEL.18
2.3.1.1. REZEPTORVERMITTELTE ENDOCYTOSE VOQ LDL.
.
7
.
.18
2.3.1.2. ATHEROSKLEROSE.20
2.3.2. HDL-STOFFWECHSEL.22
2.3.2.1. REVERSER CHOLESTERINTRANSFER.23
2.3.3. CEREBRALER LIPOPROTEINSTOFLWECHSEL.24
3. MATERIALIEN
.26
3.1. GERAETE.26
3.2. VERBRAUCHSMATERIAL.27
3.3. CHEMIKALIEN.27
4. METHODEN
.31
4.1. ZELLPRAEPARATION UND ZELLKULTUR.31
4.1.1. KAPILLAERE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).31
4.1.2. PERICYTEN.33
4.1.3. EPITHELZELLEN DES
PLEXUS CHORIOIDEUS AUS SCHWEINEHIM.33
4.1.4. ASTROCYTEN.35
4.1.5. AORTALE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEIN (PAEC).36
4.1.6. MDCK-I- UND MDCK-II-ZELLEN.36
4.1.7. 3T3-FIBROBLASTEN.37
4.2. ALLGEMEINE KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN.37
4.2.1. KULTURBEDINGUNGEN.37
4.2.2. PASSAGIEREN.37
4.2.3. EINFRIEREN UND AUFTAUEN.38
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/952155443
INHALTSVERZEICHNIS
II
4.2.4. PRAEPARATION VON RATTENSCHWANZ-COLLAGEN.38
4.3. LIPOPROTEINE.39
4.3.1. ISOLIERUNG VON LIPOPROTEINEN AUS BLUTPLASMA.39
4.3.2. MODIFIKATION VON LIPOPROTEINEN.40
4.3.2.1. MARKIERUNG VON LDL MIT L,L'-DIOCTADECYL-3,3,3',3'-
TETRAMETHYL-INDOCARBOCYANIN-PERCHLORAT (DIL).40
4.3.2.2. ACETYLIERUNG VON LDL UND DIL-LDL. 41
4.3.2.3. KOPPLUNG VON LDL MIT [
14C]-SUCROSE.41
4.3.2.4. KOPPLUNG VON LIPOPROTEINEN PIIT KOLLOIDALEN GOLDPARTIKELN.42
4.3.3. UEBERPRUEFUNG DES OXIDATIONSZUSTANDES VON LDL.43
4.3.4. ROUTINE-AGAROSEGELELEKTROPHORESE.44
4.3.5. PROTEINBESTIMMUNGEN.45
4.3.5.1. PROTEINBESTIMMUNG MIT BICHINCHONINSAEURE.45
4.3.5.2. PROTEINTEST NACH LOWRY.^.
.
7
:
.45
4.4. HISTOCHEMIE.46
4.4.1. OBERFLAECHENREPLIKATION.46
4.4.2. IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNGEN.46
4.4.2.1. FAERBUNG DES VON-WILLEBRAND-FAKTORS.47
4.4.2.2. FAERBUNG VON ZO-1.48
4.4.2.3. KONFOKALE LASER-SCAWH/JG-FLUORESZENZ-MIKROSKOPIE.48
4.5. APOA-I-SANDWICH-ELISA.50
4.6. GELELEKTROPHORETISCHE TECHNIKEN.52
4.6.1. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.52
4.61.1. COOMASSIE-FAERBUNG VON SDS-GELEN.54
4.6.1.2. WESTERN-BLOT.54
4.6.1.3. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN IM WESTERN-BLOT.55
4.6.2. NICHTDENATURIERENDE ZWEIDIMENSIONALE AGAROSE-
POLYACRYLAMIDGRADIENTEN-GELELEKTROPHORESE (2D-PAGGE).55
4.6.2.1. ERSTE DIMENSION: AGAROSEGELELEKTROPHORESE.55
4.6.2 2. ZWEITE DIMENSION: POLYACRYLAMIDGRADIENTEN-GELELEKTROPHORESE.56
4.7. MESSUNG DES ELEKTRISCHEN WIDERSTANDES VON ZELLMONOLAYEM.57
4.8. PERMEABILITAETSSTUDIEN.62
5. ERGEBNISSE
.65
5.1. CHARAKTERISIERUNG DER LIPOPROTEINE.65
5.2. INTERNALISIERUNGS- UND BINDUNGSSTUDIEN MIT LIPOPROTEINEN.68
INHALTSVERZEICHNIS III
5.2.1. KAPILLAERE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).68
5.2.1.1. CHARAKTERISIERUNG.68
5.2.1.2. INTERNALISIERUNG VON LDL UND ACLDL.70
5.2.1.3. LOKALISIERUNG DER SPEZIFISCHEN BINDUNGSSTELLEN VON LDL UND
ACLDL.72
5.2.2. PERICYTEN AUS SCHWEINEHIM.74
5.2.3. ASTROCYTEN AUS NEONATALEM RATTENHIM.76
5.2.4. EPITHELZELLEN DES
PLEXUS CHORIOIDEUS AUS SCHWEINEHIM.78
'
5.3. ETABLIERUNG EINES SERUMFREIEN
IN VITRO MODELLS DER BLUT-HIRN-SCHRANKE.80
5.3.1. MESSUNGEN DES ELEKTRISCHEN TRANSENDOTHELIALEN WIDERSTANDES (TER)
AN KONFLUENTEN ZELLMONOLAYEM DER KAPILLAEREN ENDOTHELZELLEN
AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).80
5.3.1.1. EINFLUSS DER ZELLAUSSAATDICHTE AUF DEN ELEKTRISCHEN WIDERSTAND
DER MONOLAYER.81
5.3.1.2. EINFLUSS VON WACHSTUMSFAKTOREN UND SERUM AUF DEN TER
DER PBCEC-MONOLAYER.RRR.82
5.3 .2. PERMEABILITAETSUNTERSUCHUNGEN AN KONFLUENTEN ZELLMONOLAYEM
DER KAPILLAEREN ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).88
5.3.3. SUCROSE-PERMEABILITAETEN UND TER-WERTE VON FIBROBLASTEN,
MDCK-I- UND MDCK-II-ZELLEN.95
5.3.4. POLARITAET DER PROTEINSEKRETION VON KULTIVIERTEN KAPILLAEREN
ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).96
5.4. LIPOPROTEIN-TRANSPORTSTUDIEN AN
IN VITRO MODELLEN DER
CEREBRALEN SCHRANKENSYSTEME.98
5.4.1. PERMEABILITAETSUNTERSUCHUNGEN MIT FLUORESZENZMARKIERTEN
DEXTRANEN.99
5.4.2. TRANSPORTUNTERSUCHUNGEN MIT [14C]-LDL.101
5.4.2.1. AORTALE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEIN (PAEC).101
5.4.2.2. KAPILLAERE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).102
5.4.2 3. EPITHELZELLEN DES
PLEXUS CHORIOIDEUS AUS SCHWEINEHIM (PECCP).104
5.4.3. TRANSPORTUNTERSUCHUNGEN MIT HDL.108
5.4.3.1. KAPILLAERE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).108
5.4.3.2. EPITHELZELLEN DES PLEXUS CHORIOIDEUS AUS SCHWEINEHIM
(PECCP).109
5.4.4. ZUSAMMENSTELLUNG DER TRANSPORTRATEN VON LIPOPROTEINEN
UEBER KONFLUENTE ZELLMONOLAYER.111
5.5. CHARAKTERISIERUNG DER UEBER CEREBRALE ZELLMONOLAYER TRANSPORTIERTEN
HDL-PARTIKEL MITTELS GELELEKTROPHORESE.112
5.5.1. EPITHELZELLEN DES PLEXUS CHORIOIDEUS (PECCP).114
5.5.2. KAPILLAERE CEREBRALE ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIM (PBCEC).118
6.DISKUSSION
.121
6.1. LIPOPROTEINE. 122
INHALTSVERZEICHNIS _ _
IV
6.2. INTEMALISIERUNGS- UND BINDUNGSSTUDIEN MIT LIPOPROTEINEN.122
6.3. ENTWICKLUNG EINES
IN VITRO MODELLS DER BLUT-HIRN-SCHRANKE.125
6.4. LIPOPROTEIN-TRANSPORTSTUDIEN AN
IN VITRO MODELLEN
DER CEREBRALEN SCHRANKENSYSTEME.131
7. ZUSAMMENFASSUNG
.134
8. LITERATURVERZEICHNIS
.'.136 |
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