Molekulargenetische Analyse des Gens MONOPTEROS von Arabidopsis thaliana:
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1997
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adam_text | HS4-3 - MR^S 3 MOLEKULARGENETISCHE ANALYSE DES GENS MONOPTEROS VON
ARABIDOPSIS THALIANA DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES DOKTORS
DER NATURWISSENSCHAFTEN DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN VORGELEGT VON CHRISTIAN S.
HARDTKE 1997 IV INHALT 1. EINLEITUNG 1 1.1 ENTWICKLUNGSBIOLOGISCHE
MODELLORGANISMEN 1 1 .2 ARABIDOPSIS THALIANA ALS MODELLORGANISMUS FUER
DIE ENTWICKLUNG DER BLUETENPFLANZEN 2 1.3 AN DER EMBRYONALEN
MUSTERBILDUNG BETEILIGTE GENE VON ARABIDOPSIS THALIANA 4 1.4 DIE
MONOPTEROS-MXTIANTEN 5 2. ERGEBNISSE 9 2.1 MESSUNG DES POLAREN
AUXINTRANSPORTS 9 2.2 POSITIONALE KLONIERUNG DES MONOPTEROS-GENS 11
2.2.1 MOLEKULARE VERWANDSCHAFT VON ARABIDOPSIS THALIANA OEKOTYPEN 13
2.2.2 KARTIERUNG DES MP-LOCUS 16 2.2.3 UEBERSPANNEN DES MP-LOCUS DURCH
CHROMOSOME WALKING MIT YACS 20 2.2.4 FEINKARTIERUNG DES AFP-LOCUS 24
2.2.4.1 ISOLATION VON CDNA-KLONEN IN DER REGION DES AFP-GENS 27 2.2.5
LOKALISATION DES AFP-GENS ANHAND ALLELSPEZIFISCHER
RESTRIKTIONSPOLYMORPHISMEN 27 2.2.5.1 IDENTIFIKATION EINES POTENTIELLEN
AFP-TRANSKRIPTS MITTELS HOCHAUFLOESENDER SOUTHERN BLOTS 28 2.2.6
IDENTIFIKATION DES AFP-GENS ANHAND VON SEQUENZPOLYMORPHISMEN IN MEHREREN
MP- ALLELEN 30 2.2.7 CHARAKTERISIERUNG DER AFP-TRANSKRIPTIONSEINHEIT
30 2.2.8 CHARAKTERISIERUNG DER GENOMISCHEN SEQUENZ DES AFP-GENS 32 2.2.9
SEQUENZANALYSE DES A/P-GENS 32 2.2.9.1 ANALYSE DER DNA-SEQUENZ 34
2.2.9.2 ANALYSE DER AUS DEM TRANSKRIPT ABGELEITETEN MP-PROTEINSEQUENZ 34
2.2.9.3 SEKUNDAERSTRUKTUR-ANALYSE DES MP-PROTEINS 36 2.3 NACHWEIS DES
NUKLEAREN IMPORTS DES MP-PROTEINS 37 2.3.1 HERSTELLUNG DER
REPORTERKONSTMKTE 37 2.3.2 TRANSIENTE EXPRESSION DER REPORTERKONSTRUKTE
IN ZWIEBEL-EPIDERMISZELLEN 39 2.4 ANALYSE DER EXPRESSION DES AFP-GENS
DURCH IN IIFU-HYBRIDISIERUNG 41 2.4.1 HERSTELLUNG DER KONSTRUKTE FUER DIE
IN VI/RA-TRANSKRIPTION VON AFP-FRAGMENTEN 41 2.4.2 ERGEBNISSE DER IN
M-HYBRIDISIERUNG 42 2.5 ANALYSE DER EXPRESSION DES AFP-GENS DURCH EIN
REPORTERGEN IN TRANSGENEN PFLANZEN 44 2.5.1 HERSTELLUNG EINER TRANSGENEN
PFLANZE MIT EINER PROMOTOR-REPORTERGEN-FUSION 45 2.5.2 GUS-EXPRESSION IN
TRANSGENEN PFLANZEN UNTER EINFLUSS DES AFP-PROMOTORS 46 3. DISKUSSION 47
3.1 MOLEKULARE VERWANDSCHAFT VON ARABIDOPSIS THALIANA OEKOTYPEN 47 3.1.1
ZUR METHODIK DER DATENERHEBUNG 47 3.1.2 SIGNIFIKANZ DER BEOBACHTETEN
VERWANDSCHAFTSGRADE 48 3.2 POSITIONALE KLONIERUNG DES AFP-GENS 49 3.2.1
ZUR RFLP-KARTIERUNG 49 3.2.2 CHROMOSOME WALKING IN ARABIDOPSIS THALIANA
50 3.2.3 EINGRENZUNG DES GENORTS AUF COSMID-EBENE 52 3.2.4 METHODEN ZUR
LOKALISATION DES GENS 53 3.3. DER POLARE AUXINTRANSPORT 54 3.3.1 DIE
BEZIEHUNG ZWISCHEN AUXIN UND DER MP-MUTATION 55 3.4 DAS
EXPRESSIONSMUSTER DES AFP-GENS 56 3.4.1 DIE EXPRESSIONSDOMAENEN DES GENS
STIMMEN WEITGEHEND MIT DEN DEFEKTEN IN DER MUTANTE UEBEREIN 57 3.4.2 DIE
EMBRYONALE EXPRESSION WEIST AUF EINEN ZUM AFP-GEN REDUNDANTEN FAKTOR HIN
58 3.5 CHARAKTERISTIKA DES MP-PROTEINS 59 3.5.1 DIE HOMOLOGIE ZU DEN
PROTEINEN DER AUXIN-INDUZIERBAREN GENFAMILIE 59 3.5.2
KERNLOKALISATIONSSIGNALE IM MP-PROTEIN 60 3.5.3 MOEGLICHE WIRKUNGSWEISEN
DES MP-PROTEINS 61 3.6 DIE ROLLE DES AFP-GENS IN DER PFLANZENENTWICKLUNG
62 4. MATERIAL UND METHODEN 63 4.1 MATERIAL 63 4.1.1 CHEMIKALIEN,
ANTIBIOTIKA UND FILMMATERIAL 63 4.1.2 ENZYME UND MOLEKULARBIOLOGISCHE
MATERIALIEN 63 4.1.3 BIBLIOTHEKEN 63 4.1.4 DNA-VEKTOREN 64 4.1.5
PFLANZENMATERIAL 64 4.2 METHODEN 64 4.2.1 METHODEN FUER ESCHERICHIA COLI
UND AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 64 4.2.1.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER
ESCHERICHIA COLI- UND AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-TZUEEN 64 VI 4.2.1.2
ELEKTROTRANSFORMATION VON ESCHERICHIA COLI UND AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
65 4.2.1.3 PRAEPARATION LINKER YAC-ENDEN VON BIBLIOTHEKEN IN PYAC4 UND
DERIVATEN MITTELS PLASMID RESCUE 65 4.2.2 METHODEN FUER SACCHAROMYCES
CEREVISIAE 66 4.2.2.1 HERSTELLUNG VON HYBRIDISIERUNGSFILTERN VON
YAC-BIBLIOTHEKEN 66 4.2.2.2 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS HEFE 67
4.2.2.3 PULSFELDGELELEKTROPHORESE VON YACS 67 4.2.3 METHODEN FUER
ARABIDOPSIS 68 4.2.3.1 RFLP-KARTIERUNG 68 4.2.3.2 PRAEPARATION VON
PFLANZEN-DNA FUER GENOMISCHE SOUTHERN BLOTS 68 4.2.3.3 MINI-PRAEPARATION
VON PFLANZEN-DNA FUER PCR 69 4.2.3.4 BEWURZELUNG VON MP-KEIMLINGEN 70
4.2.3.5 MESSUNG DES POLAREN AUXINTRANSPORTS 70 4.2.3.6 IN
FU-HYBRIDISIERUNG AN GEWEBESCHNITTE 70 4.2.3.6.1 FIXIERUNG, EINBETTUNG
UND SCHNEIDEN 70 4.2.3.6.2 VORBEREITUNG FUER DIE HYBRIDISIERUNG 72
4.2.3.6.3 IN J/YU-HYBRIDISIERUNG 72 4.2.3.6.4 AUTORADIOGRAPHIE DER
HYBRIDISIERTEN OBJEKTTRAEGER 73 4.2.3.7 AGROBACTERIUM-VERMITTEHE
TRANSFORMATIO N VON ARABIDOPSIS 74 4.2.4 BIOLISTISCHE TRANSFORMATION VON
ZWIEBEL-EPIDERMISZELLEN 74 4.2.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 75
4.2.5.1 HYBRIDISIERUNG VON DNA-SONDEN 75 4.2.5.2 CAPS-MARKER 76 4.2.5.3
VEKTORETTE-PCR ZUR SELEKTIVEN AMPLIFIKATION VON TERMINI VON YAC-INSERTS
76 4.2.5.4 HERSTELLUNG HOCHAUFLOESENDER SOUTLIERN BLOTS 77 4.2.5.5
DNA-SEQUENZIERUNG 78 4.2.5.6 RACE 78 4.2.5.7 IN VIFRO-TRANSKRIPTION FUER
DIE HERSTELLUNG 3S S-MARKIERTER SONDEN 79 4.2.6 BIOINFORMATIK 79 4.2.6.1
PHYLOGENETISCHE ANALYSE 79 4.2.6.2 SEQUENZANALYSE DES AFP-GENS UND
MP-PROTEINS 80 5. LITERATUR 81 6. ZUSAMMENFASSUNG 92
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