Charakterisierung eines Talin-ähnlichen Zytoskelettproteins aus Dictyostelium discoideum:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
TALIN
IN
VERTEBRATENZELLEN
1
1.2
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
ALS
MODELL
EINER
NICHT-MUSKELZELLE
S
1.3
TALIN
IN
D.
DISCOIDEUM
7
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
10
2.1
MATERIAL
10
2.1.1
ZELLEN
10
2.1.2
VEKTOREN
10
2.1.3
ENZYME,
ANTIKOERPER
UND
KITS
10
2.1.4
INHIBITOREN
UND
ANTIBIOTIKA
11
2.1.5
REAGENZIEN
UND
STANDARDS
12
2.1.6
RADIOCHEMIKALIEN
14
2.1.7
MEDIEN,
PUFFER
UND
ANDERE
LOESUNGEN
14
2.1.8
VERBRAUCHSMATERIAL
16
2.1.9
GERAETE
17
2.1.10
COMPUTERPROGRANUNE
19
2.2
D.-DISCOIDEUM-KULTUR
19
2.2.1
ANZUCHT
IN
AXENISCHER
SCHUETTELKULTUR
19
2.2.2
ANZUCHT
AUF
AGARPLATTEN
19
2.2.3
WACHSTUM
IN
BAKTERIENSUSPENSIONSKULTUR
20
2.2.4
ENTWICKLUNG
IN
SUSPENSION
20
2.2.5
SPORENGEWINNUNG
UND
KONSERVIERUNG
20
2.2.6
ZELLZYKLUS-SYNCHRONISIERUNG
20
2.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
21
2.3.1
TRANSFORMATION
VON
D.
DISCOIDEUM
DURCH
ELEKTROPORATION
UND
SELEKTION
21
2.3.2
HERSTELLUNG
TIANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
COLI
22
2.3.3
TRANSFORMATION
VON
.
COLI
UND
SELEKTION
23
2.3.4
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
23
2.3.5
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
D.
DISCOIDEUM
24
2.3.6
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
D.
DISCOIDEUM
25
2.3.7
VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
25
2.3.8
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
25
2.3.9
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
FUER
PCR
26
2.3.10
DNA-LIGASE-REAKTION
28
2.3.11
DNA-DEPHOSPHORYLIERUNG
AM
5'-ENDE
28
2.3.12
UEBERFUEHRUNG
VON
UEBERHAENGENDEN
5'-ENDEN
IN
GLATTE
ENDEN
28
2.3.13
UEBERFUEHRUNG
VON
UEBERHAENGENDEN
3'-ENDEN
IN
GLATTE
ENDEN
29
2.3.14
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
2.3.15
32
P-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
2.3.16
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
30
2.3.17
FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
DNA-GELEN
30
2.3.18
SOUTHEM-BLOTTING
31
2.3.19
RNA-AGAROSE-GELEKTROPHORESE
UND
NORTHEM-BLOTTING
31
2.3.20
KOLONIE-BLOTTING
VON
E.-CO/I-KOLONIEN
ZUR
DNA-HYBRIDISIERUNG
32
2.3.21
HYBRIDISIERUNG
MIT
32
P-MARKIERTEN
SONDEN
32
2.3.22
SEQUENZIERUNG
NACH
DER
KETTENABBRUCHMETHODE
32
INHALTSVERZEICHNIS
2.4
PROTEINCHEMISCHE
UND
-ANALYTISCHE
METHODEN
34
2.4.1
KOLONIE-BLOTTING
VON
D.-DISCOIDEUM-KALOMEN
ZUR
PROTEIN-DETEKTION
34
2.4.2
EXPRESSIONREKOMBINANTER
"
HIS-TAG
"
-PROTEINE
IN
.
CO/IM15
35
2.4.3
BESTIMMUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
LOKALISATION
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
35
2.4.4
REINIGUNG
VON
"
HIS-TAG
"
-PROTEINEN
UEBER
NI
2+
-NTA-AFIINITAETSCHROMATOGRAFIE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
36
2.4.5
ZELLAUFSCHLUSS
VON
E.
COLI
IN
DER
"
FRENCH
PRESSURE
CELL
"
37
2.4.6
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAFIE
37
2.4.7
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
38
2.4.8
NI
2+
-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE
UNTER
NICHT-DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
39
2.4.9
REINIGUNG
VON
AKTIN
AUS
KANINCHENSKELETTMUSKEL-EXTRAKT
39
2.4.10
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
40
2.4.11
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
41
2.4.12
WESTEM-TRANSFER
VON
PROTEINEN
UND
IMMUNDETEKTION
42
2.4.13
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
43
2.4.14
NACHWEIS
DER
AKTINBINDUNG
DURCH
KOSEDIMENTATION
MIT
F-AKTIN
43
2.4.15
ANALYSE
DER
F-AKTINBINDUNG
VON
TALC63
AM
BIACORE-SYSTEM
44
2.5
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
47
2.5.1
IMMUNISIERUNG
VON
BALB/C-MAEUSEN
47
2.5.2
FUSION
VON
B-LYMPHOZYTEN
UND
MYELOMZELLEN
48
2.5.3
TESTEN
DER
UEBERSTAENDE
UND
KLONIEREN
DER
HYBRIDOMZELLEN
49
2.5.4
KONSERVIERUNG
DER
HYBRIDOMKLONE
49
2.5.5
REINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
50
2.5.6
IMMUNPRAEZIPITATION
50
2.6
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
52
2.6.1
BESTIMMUNG
VON
PROTEINGEHALT
UND
ZELLVOLUMEN
VON
D.-DISCOIDEUM-ZEHEN
52
2.6.2
FIXIERUNG
VON
D.
-DISCOIDEUM-ZELLEA
UND
IMMUNFLUORESZENZ-MARKIERUNG
52
2.6.3
CHEMOTAKTISCHE
STIMULATION
VON
D.
DISCOIDEUM
DURCH
EINE
CAMP-GEFTILLTE
MIKROKAPILLARE
53
2.6.4
BESTIMMUNG
VON
PHAGOZYTOSE
UND
PINOZYTOSERATEN
54
2.6.5
KONFOKALE
IN-VIVO-FLUORESZENZMIKROSKOPIE
AN
PHAGOZYTIERENDEN
TLELLEN
55
2.6.6
QUANTIFIZIERUNG
DER
ZELL-SUBSTRAT-ADHAESION
AN
VEGETATIVEN
ZELLEN
55
2.6.7
REFLEKTIONSINTERFERENZKONTRASTMIKROSKOPIE
(RICM)
55
2.6.8
MESSUNG
DER
ZELL-ZELL-ADHAESION
IM
AGGLUTINOMETER
56
2.6.9
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE
56
3.
ERGEBNISSE
57
3.1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
TALIN-NULL-MUTANTE
IN
D.
DISCOIDEUM
57
3.1.1
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
GEGEN
EIN
N-TERMINALES
TALIN-FRAGMENT
57
3.1.2
KONSTRUKTION
DES
TRANSFORMATIONSVEKTORS
PTO
UND
TRANSFORMATION
59
3.1.3
MOLEKULARE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TALIN-NULL-MUTANTE
61
3.1.4
VERZOEGERTE
ENTWICKLUNG
DER
TALIN-NULL-MUTANTE
64
3.1.5
DIE
TALIN-NULL-MUTANTE
ZEIGT
EINEN
ADHAESIONSDEFEKT
IN
VEGETATIVEN
UND
AGGREGATIONSKOMPETENTEN
ZELLEN
65
3.1.6
DIE
TALIN-NULL-MUTANTE
ZEIGT
EINEN
PHAGOZYTOSEDEFEKT,
ABER
NORMALE
PINO
ZYTOSE
68
3.1.7
DAS
WACHSTUM
DER
TALIN-NULL-MUTANTE
IN
BAKTERIENSUSPENSIONSKULTUR
HAENGT
VON
DER
ADHAESIVITAET
DER
BAKTERIENOBERFLAECHE
AB
71
3.1.8
DIE
TALIN-NULL-MUTANTE
BILDET
KEINE
EDTA-SENSITIVEN
ZELL-ZELL-KONTAKTE
73
3.1.9
DER
ZYTOKINESEDEFEKT
DER
TALIN-NULL-MUTANTE
77
INHALTSVERZEICHNIS
3.2
NACHWEIS
DER
BINDUNG
EINES
C-TERMINALEN
63-KDA-TAIIN-FRAGMENTS
AN
AKTIN
81
3.2.1
EXPRESSION
VON
TALC63
IN
E.
COLI
81
3.2.2
NACHWEIS
DER
AKTIN-BINDUNG
VON
TALC63
DURCH
KOSEDIMENTATION
84
3.2.3
UNTERSUCHUNG
DER
AKTIN-BINDUNG
AM
BIACORE-2000-PLASMONRESONANZ-SENSOR
86
3.3
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
BESTEHEND
AUS
GFP
UND
C-TERMINALEN
TALIN
FRAGMENTEN
IN
D.
DISCOIDEUM
90
3.3.1
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
PDNEOGFP
90
3.3.2
EXPRESSION
VON
GFP-TALC2
1
IN
AX2
92
3.3.3
EXPRESSION
VON
GFP-TALC63
IN
AX2
UND
DER
TALIN-NULL-MUTANTE
HG1666
92
4.
DISKUSSION
106
4.1
DIE
TALIN-NULL-MUTANTE
106
4.2
DIE
BINDUNG
EINES
C-TERMINALEN
D.-DBCOUETEUM-TALIN-FRAGMENTS
AN
F-AKTIN
116
4.3
SUBMEMBRANE
LOKALISATION
VON
GFP-TALC63
UND
UNTERDRUECKUNG
DER
FILOPODIENBILDUNG
119
5.
ZUSAMMENFASSUNG
124
6.
LITERATURVERZEICHNIS
127
7.
ANHANG
141
7.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
141
73.
NUKLEOTID
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
TALIN
143
73
POSITIONEN
DER
OLIGONUKLEOTIDE
UND
REKOMBINANTEN
PROTEINE
150 |
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