Klonierung und Charakterisierung neuer GTPasen der Ras-Familie (ARL1, ARL4, ARP, Rag und Rab28):
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Aachen, Techn. Hochsch., Habil.-Schr., 1997 |
| Beschreibung: | 111 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1_
EINLEITUNG_L
1.1 UNTERFAMILIEN DER RAS-FAMILIE 4
1.1.1 DIE RAS-FAMILIE 4
1.1.2 DIE RHO-FAMILIE 6
1.1.3 DIE RAN-FAMILIE 8
1.1.4 DIE RAB-FAMILIE 8
1.1.5 DIEARF-FAMILIE 10
1.2 DIE STRUKTUR DER GTPASEN DER RAS-FAMILIE 11
1.3 POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN DER GTPASEN DER RAS-FAMILIE 13
1.4 ZIEL DER VORLIEGENDEN ARBEIT 14
2._
MATERIAL UND METHODEN_17
2.1 E. COLI STAMM 17
2.2 VEKTOREN V 17
2.3 BIBLIOTHEKEN 17
2.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARDMETHODEN 17
2.5 KLONIERUNG NEUER GTPASEN DER ARF-FAMILIE 18
2.5.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ZUR KLONIERUNG NEUER GTPASEN DER
ARF-
FAMILIE 18
2.5.2 CDNA-SYNTHESE 18
2.5.3 UMKLONIERUNG DER PCR-PRODUKTE IN DEN VEKTOR PUC 18 19
2.6 5-RACE ('RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS') ZUR AUFKLAERUNG DES
5'-ENDES
VON ARP UND RAB28 19
2.7 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER NEUEN GTPASEN 20
2.7.1 EXPRESSION NEUER GTPASEN IN
E.COLI 20
2.7.2 HPLC-ANALYSE DER REKOMBINANTEN G-PROTEINE 20
2.7.3 GTP-BINDUNG AN REKOMBINANTE G-PROTEINE 21
2.7.4 BESTIMMUNG DER INTRINSISCHEN GTPASE-AKTIVITAET 21
2.8 ZELLKULTUR 22
2.9 EXPRESSION VON ARP IN COS-7-ZELLEN 22
2.10 EXPRESSION VON ARL4 IN COS-7-ZELLEN 23
2.11 MEMBRANFRAKTIOMERUNG DER TRANSFIZIERTEN COS-7-ZELLEN 23
2.12 WESTERN BLOT-ANALYSE 23
2.12.1 ANTIKOERPER 23
2.12.2 SDS-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) UND WESTERN BLOT 24
2.13 NACHWEIS DES ALTERNATIVEN SPLEISSENS VON RAGB 24
2.14 NACHWEIS DES ALTERNATIVEN SPLEISSENS BEIM HRAB28 25
2.15 HERSTELLUNG EINER DELETIONSMUTANTE VON RAGB MITTELS
'SITE-DIRECTED'-MUTAGENESE 25
2.16 HERSTELLUNG VON DELETIONS- UND PUNKTMUTANTEN VON ARP 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/951470744
INHALTSVERZEICHNIS
ERGEBNISSE
27
3 1 PCR-KLONIERUNG VON GTPASEN DER RAS-FAMILIE
3.2 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION VON ARF- UND ARL-PROTEINEN IN
VERSCHIEDENEN
RATTENGEWEBEN
3.3 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION VON ARF- UND ARL-PROTEINEN IN 3T3-L1
-TELLEN
3.4 DIE NEUEN GTPASEN ARLI UND ARL4
3.4.1 SEQUENZEN DER NEUEN GTPASEN ARL 1 UND ARL4
3.4.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER NEUEN GTPASE ARL4
3.4.2.1 EXPRESSION VON ARL4 ALS GST-FUSIONSPROTEIN IN
KCOLI
3.4.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER GTP-BINDUNG, DES GTP-AUSTAUSCHES UND DER
GTPASE-
AKTIVTAET VON ARL4
3.4.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER SUBZELLULAEREN VERTEILUNG VON ARL4 NACH
EXPRESSION IN
COS-7-ZELLEN
3.5 DIE NEUE GTPASE ARP (ARF RELATED PROTEIN)
3.5.1 SEQUENZ DER NEUEN GTPASE ARP
3 .5.2 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION VON ARP IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN DER
RATTE
3.5.2.1 NORTHERN BLOT-ANALYSE VON ARP
3.5.2 2 WESTERN BLOT-ANALYSE VON ARP
3.5.3 UNTERSUCHUNG DER SUBZELLULAEREN VERTEILUNG VON ARP
3.5.4 UNTERSUCHUNG DER SUBZELLULAEREN VERTEILUNG NACH DELETION DES
N-TERMINUS UND
NACH AUSTAUSCH DES TYROSINS-2
3.5.5 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DES REKOMBINANTEN ARP
3.5.5.1 EXPRESSION VON ARP ALS GST-FUSIONSPROTEIN IN
DH5A-ZEL\EN
3.5.5 2 BESTIMMUNG DER GTP-BINDUNG, DES NUKLEOTIDAUSTAUSCHES UND DER
GTPASE-
AKTIVITAET VON ARP
3.5.6 IDENTIFIZIERUNG VON ZWEI FUER DEN NUKLEOTIDAUSTAUSCH UND DIE
GTP-BINDUNG
ESSENTIELLEN AMINOSAEUREN VON ARP
3.6 DIE NEUEN GTPASEN RAGA UND RAGB
3.6.1 SEQUENZ VON RAGA
3.6.2 SEQUENZ VON RAGB
3.6.3 VERGLEICH VON RAGA UND RAGB MIT ANDEREN GTPASEN
3.6.4 NACHWEIS DES ALTERNATIVEN SPLEISSENS VON RAGB
3.6.5 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION VON RAGA UND RAGB
3.6.5.1 GEWEBSVERTEILUNG VON RAGA UND DEN BEIDEN ISOFORMEN VON RAGB
(RAGB* UND
RAGB1)
3.6.5.2 NORTHERN BLOT-ANALYSE DER EXPRESSION VON RAGA UND RAGB IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN DER RATTE
3.6.6 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON RAGA UND RAGB
3.6.6.1 EXPRESSION VON RAGA UND RAGB IN
DH5A-ZSSLLEN
3.6.6.2 BESTIMMUNG DER GTP-BINDUNG, DES NUKLEOTIDAUSTAUSCHES UND DER
GTPASE-
AKTIVITAET VON RAGA UND RAGB
27
29
31
34
34
37
37
38
39
41
41
43
43
44
45
46
49
49
51
53
56
56
58
60
61
62
63
64
65
65
66
INHALTSVERZEICHNIS
3.7 DIE NEUE GTPASE RAB28 68
3.7.1 DIE SEQUENZ VON RAB28 68
3.7.2 VERGLEICH VON RAB28 MIT ANDEREN GTPASEN DER RAS-FAMILIE 68
3.7.3 NACHWEIS DES ALTERNATIVEN SPLEISSENS VON RAB28 70
3.7.4 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION VON RAB28 72
3.7.5 GEWEBSVERTEILUNG DER BEIDEN ISOFORMEN VON HRAB28 (HRAB28
S UND HRAB28') 73
3.7.6 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON RAB28 74
3.7.6.1 EXPRESSION VON RAB28 IN
E.COLI 74
3.76.2 GTP-BINDUNG UND GTPASE-AKTIVITAET VON RAB28 74
4K_
DISKUSSION_76
4.1 ARP, EINE GTPASE MIT ENTFERNTER AEHNLICHKEIT ZUR ARF-FAMILIE 76
4.1.1 STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG VON ARP 76
4.1.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON ARP 77
4.1.3 WELCHE DOMAENE VON ARP IST FUER DIE LOKALISATION IN DER
PLASMAMEMBRAN
VERANTWORTLICH? 79
4.1.4 NACH VERLUST DES N-TENTIINUS WIRD ARP STAERKER EXPNMIERT ALS DER
WILDTYP 80
4.1.5 DIE AMINOSAEUREN ASPARTAT-16 UND GLUTAMAT-17 VON ARP SPIELEN FUER
DEN
NUKLEOTIDAUSTAUSCH EINE WICHTIGE ROLLE 81
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER NEUEN GTPASEN ARL1 UND ARL4 82
4.3 RAG: EINE NEUE UNTERFAMILIE VON GTP-BINDENDEN PROTEINEN DER
RAS-FAMILIE 84
4.3.1 STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON RAGA UND RAGB
84
4.3.2 RAG, DIE NEUE UNTERFAMILIE DER RAS-HOMOLOGEN GTPASEN 86
4.3.3 UNTERSCHIEDE ZWISCHEN RAGA UND RAGB 87
4.4 RAB28, EIN NEUES MITGLIED DER RAB-FAMILIE 87
4.4.1 DIE STRUKTUR VON RAB28 88
4.4.2 GEWEBSSPEZIFISCHE EXPRESSION VON RAB28 88
4.5 DAS ALTERNATIVE SPLEISSEN BEI GTPASEN DER RAS-FAMILIE 89
5,_
ZUSAMMENFASSUNG_92
6._LITERATUR_95
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 110
DANKSAGUNG
112 |
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