Charakterisierung des humanen Gens für das peroxisomale farnesylierte Protein PxF: ein Kandidatengen für einen peroxisomalen Biogenesedefekt
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INHALTSVERZEICHNIS
A
EINLEITUNG.
1
B
MATERIAL
UND
METHODEN.
15
I
MATERIAL.
.
15
1
CHEMIKALIEN
.
15
2
ENZYME
UND
NUKLEOTIDE
.
15
3
MEMBRANEN
UND
BLOTTINGPAPIER
.
15
4
AFFINITAETSSAEULEN
UND
-MATRICES
.
15
5
SYNTHESE
UND
NACHWEIS-KITS,
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
16
6
LAENGENSTANDARDS
.
16
7
BAKTERIEN,
GENBANKEN
UND
VEKTOREN
.
16
8
ZELLINIEN,
KULTURMEDIEN
UND
TRANSFEKTIONSREAGENS
.
17
9
OLIGONUKLEOTID-PRIMER
.
18
10
SPEZIELLE
GERAETE
.
18
N
METHODEN
1
ETABLIERTE
METHODEN
.
20
2
HERSTELLUNG
VON
HS-PXF
SPEZIFISCHEN
SONDEN
.
20
3
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
VON
GENOMISCHEN
UND
CDNA-KLONEN
.
21
3.1
SCREENING
DER
GENBANKEN
.
21
3.2
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
DER
KLONE
.
21
4
SOUTHERN
UND
NORTHERN
BLOT
ANALYSEN
.
Y.
22
4.1
PRAEPARATION,
AUFTRENNUNG
UND
TRANSFER
VON
DNA
UND
RNA-PROBEN
.
22
4.2
VERWENDETE
SONDEN
UND
HYBRIDISIERUNG:
.
22
5
REVERSE
TRANSKRIPTIONS-PCR
(RT-PCR)
.
23
5.1
RNA-PRAEPARATION
.
23
5.2 REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
PCR
.
23
6
AMPLIFIKATION
VON
CDNA
5
'
UND
3
'
FRAGMENTEN
.
24
6.1
5
'
-RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)-PCR
.
24
6.2
CDNA-BANK-PCR
.
25
II
7
AMPLIFIKATION
GENOMISCHER
129
SVJ
MAUS
FRAGMENTE
.
25
8
IN VITRO
EXPRESSION
IM
EUKARYONTISCHEN
EXPRESSIONSVEKTOR
.
26
8.1
HERSTELLUNG
DER
PCDNA3-KONSTRUKTE
.
26
8.2
IN
VITRO
TRANSLATION,
ELEKTROPHORESE
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
27
8.3
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
27
9
LUCIFERASE-REPORTERGEN
ASSAYS
.
28
9.1
HERSTELLUNG
DER
LUCIFERASE-REPORTERGEN
KONSTRUKTE
.
28
9.2
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
DER
LIPOFEKTIN-METHODE
.
29
9.3
NACHWEIS
DER
LUCIFERASE-AKTIVITAET
.
29
10
FLUORESZENZ
IN
SITU HYBRIDISIERUNG
.
29
11
PROKARYONTISCHE
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
30
11.1
HERSTELLUNG
DER
GST/HS-PXF-KONSTRUKTE
.
30
11.2
EXPRESSION,
REINIGUNG
UND
AUFTRENNUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
.
30
12
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
.
31
13
IMMUN-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
31
14
FAMESYLIERUNGSASSAY
.
32
C
ERGEBNISSE
.33
I
CHARAKTERISIERUNG
DES
HUMANEN
GENS
HS-PXF
UND
ORTHOLOGER
SEQUENZEN
WEITERER
SAEUGETIER-SPEZIES
33
1
UNTERSUCHUNGEN
AUF
DER
EBENE
VON
CDNA
UND
RNA
.
33
1.1
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
HUMANEN
VOLLE-LAENGE
CDNA
.
33
1.1.1
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
UND
PCR-FRAGMENTEN
.
33
1.1.2
ZUORDNUNG
DER
ALTERNATIV
POLYADENYLIERTEN
TRANSKRIPTE
IM
NORTHERN
BLOT
.
36
1.2
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
CODIERENDEN
PXF
SEQUENZEN
ANDERER
SAEUGETIER-SPEZIES
.
37
1.2.1
SEQUENZ
DER
CODIERENDEN
REGION
DES
MAUSGENS
.
37
1.2.2
SEQUENZ
DER
CODIERENDEN
REGION
DES
RATTENGENS
.
37
1.3
VERGLEICHENDE
ANALYSE
DER
CODIERENDEN
BEREICHE
.
38
2
UNTERSUCHUNGEN
AUF
DER
EBENE
GENOMISCHER
DNA
.
39
2.1
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
HUMANEN
GENS
HS-PXF
.
39
2.1.1
ISOLIERUNG
UND
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
GENOMISCHER
HS-PXF
KLONE
.
39
2.1.2
AUFKLAERUNG
DER
GENOMISCHEN
STRUKTUR
VON
HS-PXF
.
39
III
2.2
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
ORTHOLOGEN
GENS
DER
MAUS
MM-PXF
.
40
2.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
129SVJ
MAUS-KLONE.
40
2.2.2
AUFKLAERUNG
DER
GENOMISCHEN
ORGANISATION
VON
MM-PXF
.
42
2.3
IDENTIFIZIERUNG
KURZER
REPETITIVER
SEQUENZEN
.
45
3
CHARAKTERISIERUNG
DER
5
'
FLANKIERENDEN
REGION
UND
ABGRENZUNG
DES
BASALEN
PROMOTORS
.
47
3.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
MOTIVEN
UND
ELEMENTEN
.
47
3.2
UNTERSUCHUNG
AUF
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERENDE
KAPAZITAET
DER
VERMEINTLICHEN
PROMOTORREGION
.
49
4
IDENTIFIZIERUNG
UNTERSCHIEDLICHER
SPLEISSVARIANTEN
IN
ALLEN
GETESTETEN
ZELLEN
UND
GEWEBEN
.
53
4.1
UNTERSUCHUNG
VON
CDNA-KLONEN
UND
RT-PCR-PRODUKTEN
.
54
.
4.2
UNTERSUCHUNG
VERSCHIEDENER
ZELLEN
UND
GEWEBE
.
54
4.3
IN
VITRO
TRANSLATION
DER
SPLEISSVARIANTEN
.
55
5
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
DURCH
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
58
6
IDENTIFIZIERUNG
VON
HS-PXF
ALS
SINGLE-COPY
GEN
BEI
HOEHEREN
EUKARYONTEN
.
59
6.1
SOUTHERN
BLOT
ANALYSEN
INDIVIDUELLER
HUMANER
DNA-PROBEN
.
59
6.2
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
VON
NEUN
EUKARYONTISCHEN
SPEZIES
.
59
II
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SUBZELLULAEREN
LOKALISATION
UND
POSTTRANSLATIONALEN
MODIFIKATION
DES
PROTEINS
HS-PXF.
_
.
_
.61
1
PROKARYONTISCHE
EXPRESSION
VON
GST/HS-PXF
FUSIONSPROTEINEN
UND
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
.
61
3
NACHWEIS
DER
CARBOXYTERMINALEN
FAMESYLIERUNG
.
64
HI
SEQUENZVERGLEICHE
VERWANDTER
AMINOSAEURESEQUENZEN
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINER
KONSERVIERTEN
REGION
.
66
1
SEQUENZAEHNLICHKEIT
ORTHOLOGER
PXF
PROTEINE
VON
VIER
SAEUGERSPEZIES
.
66
2
SEQUENZAEHNLICHKEIT
VON
PXF
ZU
ZWEI
PROTEINEN
WENIGER
NAH
VERWANDTER
EUKARYONTEN
.
68
2.1
STARKE
AEHNLICHKEIT
DER
PROFILE
HYDROPHILER
UND
HYDROPHOBER
REGIONEN
.
69
2.2
MULTIPLES
ALIGNMENT,
ANALYSE
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINES
KONSERVIERTEN
MOTIVS
.
70
TV
D
DISKUSSION.72
1
DIE
VOLLE-LAENGE
CDNA
VON
HS-PXF'.
MULTIPLE
TRANSKRIPTE
DURCH
ALTERNATIVE
POLYADENYLIERUNG
UND
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
.
72
2
GENOMISCHE
STRUKTUR
UND
5
'
REGULATORISCHE
REGION
DER
PXF
GENE
VON
MENSCH
UND
MAUS
.
76
3
DAS
HS-PXF
PROTEIN:
FAMESYLIERUNG
UND
ASSOZIATION
MIT
PEROXISOMEN
.
81
4
KONSERVIERUNG
VON
PXF
BEI
HOEHEREN
EUKAIYONTEN
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINER
KONSERVIERTEN
REGION
.
84
5
PXF
ALS
KANDIDAT
FUER
EIN
PEROXISOMALES
ASSEMBLIERUNGSPROTEIN
.
86
E
ZUSAMMENFASSUNG
.91
F
LITERATURVERZEICHNIS.93
ANHANG
.
105
DANKSAGUNG
.
117
LEBENSLAUF.
.
119
PUBLIKATIONSLISTE
.
120 |
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| spelling | Kammerer, Stefan Verfasser aut Charakterisierung des humanen Gens für das peroxisomale farnesylierte Protein PxF ein Kandidatengen für einen peroxisomalen Biogenesedefekt von Stefan Kammerer 1997 VIII, 120 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Univ., Diss., 1997 Biogenese (DE-588)4006799-3 gnd rswk-swf Gen (DE-588)4128987-0 gnd rswk-swf Peroxisom (DE-588)4128263-2 gnd rswk-swf Farnesenderivate (DE-588)4469900-1 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Peroxisom (DE-588)4128263-2 s Biogenese (DE-588)4006799-3 s Farnesenderivate (DE-588)4469900-1 s Gen (DE-588)4128987-0 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=007815244&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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