Charakterisierung des humanen Gens für das peroxisomale farnesylierte Protein PxF: ein Kandidatengen für einen peroxisomalen Biogenesedefekt
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
A
EINLEITUNG.
1
B
MATERIAL
UND
METHODEN.
15
I
MATERIAL.
.
15
1
CHEMIKALIEN
.
15
2
ENZYME
UND
NUKLEOTIDE
.
15
3
MEMBRANEN
UND
BLOTTINGPAPIER
.
15
4
AFFINITAETSSAEULEN
UND
-MATRICES
.
15
5
SYNTHESE
UND
NACHWEIS-KITS,
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
16
6
LAENGENSTANDARDS
.
16
7
BAKTERIEN,
GENBANKEN
UND
VEKTOREN
.
16
8
ZELLINIEN,
KULTURMEDIEN
UND
TRANSFEKTIONSREAGENS
.
17
9
OLIGONUKLEOTID-PRIMER
.
18
10
SPEZIELLE
GERAETE
.
18
N
METHODEN
1
ETABLIERTE
METHODEN
.
20
2
HERSTELLUNG
VON
HS-PXF
SPEZIFISCHEN
SONDEN
.
20
3
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
VON
GENOMISCHEN
UND
CDNA-KLONEN
.
21
3.1
SCREENING
DER
GENBANKEN
.
21
3.2
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
DER
KLONE
.
21
4
SOUTHERN
UND
NORTHERN
BLOT
ANALYSEN
.
Y.
22
4.1
PRAEPARATION,
AUFTRENNUNG
UND
TRANSFER
VON
DNA
UND
RNA-PROBEN
.
22
4.2
VERWENDETE
SONDEN
UND
HYBRIDISIERUNG:
.
22
5
REVERSE
TRANSKRIPTIONS-PCR
(RT-PCR)
.
23
5.1
RNA-PRAEPARATION
.
23
5.2 REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
PCR
.
23
6
AMPLIFIKATION
VON
CDNA
5
'
UND
3
'
FRAGMENTEN
.
24
6.1
5
'
-RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)-PCR
.
24
6.2
CDNA-BANK-PCR
.
25
II
7
AMPLIFIKATION
GENOMISCHER
129
SVJ
MAUS
FRAGMENTE
.
25
8
IN VITRO
EXPRESSION
IM
EUKARYONTISCHEN
EXPRESSIONSVEKTOR
.
26
8.1
HERSTELLUNG
DER
PCDNA3-KONSTRUKTE
.
26
8.2
IN
VITRO
TRANSLATION,
ELEKTROPHORESE
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
27
8.3
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
27
9
LUCIFERASE-REPORTERGEN
ASSAYS
.
28
9.1
HERSTELLUNG
DER
LUCIFERASE-REPORTERGEN
KONSTRUKTE
.
28
9.2
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
DER
LIPOFEKTIN-METHODE
.
29
9.3
NACHWEIS
DER
LUCIFERASE-AKTIVITAET
.
29
10
FLUORESZENZ
IN
SITU HYBRIDISIERUNG
.
29
11
PROKARYONTISCHE
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
30
11.1
HERSTELLUNG
DER
GST/HS-PXF-KONSTRUKTE
.
30
11.2
EXPRESSION,
REINIGUNG
UND
AUFTRENNUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
.
30
12
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
.
31
13
IMMUN-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
31
14
FAMESYLIERUNGSASSAY
.
32
C
ERGEBNISSE
.33
I
CHARAKTERISIERUNG
DES
HUMANEN
GENS
HS-PXF
UND
ORTHOLOGER
SEQUENZEN
WEITERER
SAEUGETIER-SPEZIES
33
1
UNTERSUCHUNGEN
AUF
DER
EBENE
VON
CDNA
UND
RNA
.
33
1.1
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
HUMANEN
VOLLE-LAENGE
CDNA
.
33
1.1.1
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
UND
PCR-FRAGMENTEN
.
33
1.1.2
ZUORDNUNG
DER
ALTERNATIV
POLYADENYLIERTEN
TRANSKRIPTE
IM
NORTHERN
BLOT
.
36
1.2
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
CODIERENDEN
PXF
SEQUENZEN
ANDERER
SAEUGETIER-SPEZIES
.
37
1.2.1
SEQUENZ
DER
CODIERENDEN
REGION
DES
MAUSGENS
.
37
1.2.2
SEQUENZ
DER
CODIERENDEN
REGION
DES
RATTENGENS
.
37
1.3
VERGLEICHENDE
ANALYSE
DER
CODIERENDEN
BEREICHE
.
38
2
UNTERSUCHUNGEN
AUF
DER
EBENE
GENOMISCHER
DNA
.
39
2.1
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
HUMANEN
GENS
HS-PXF
.
39
2.1.1
ISOLIERUNG
UND
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
GENOMISCHER
HS-PXF
KLONE
.
39
2.1.2
AUFKLAERUNG
DER
GENOMISCHEN
STRUKTUR
VON
HS-PXF
.
39
III
2.2
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
ORTHOLOGEN
GENS
DER
MAUS
MM-PXF
.
40
2.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
129SVJ
MAUS-KLONE.
40
2.2.2
AUFKLAERUNG
DER
GENOMISCHEN
ORGANISATION
VON
MM-PXF
.
42
2.3
IDENTIFIZIERUNG
KURZER
REPETITIVER
SEQUENZEN
.
45
3
CHARAKTERISIERUNG
DER
5
'
FLANKIERENDEN
REGION
UND
ABGRENZUNG
DES
BASALEN
PROMOTORS
.
47
3.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
MOTIVEN
UND
ELEMENTEN
.
47
3.2
UNTERSUCHUNG
AUF
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERENDE
KAPAZITAET
DER
VERMEINTLICHEN
PROMOTORREGION
.
49
4
IDENTIFIZIERUNG
UNTERSCHIEDLICHER
SPLEISSVARIANTEN
IN
ALLEN
GETESTETEN
ZELLEN
UND
GEWEBEN
.
53
4.1
UNTERSUCHUNG
VON
CDNA-KLONEN
UND
RT-PCR-PRODUKTEN
.
54
.
4.2
UNTERSUCHUNG
VERSCHIEDENER
ZELLEN
UND
GEWEBE
.
54
4.3
IN
VITRO
TRANSLATION
DER
SPLEISSVARIANTEN
.
55
5
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
DURCH
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
58
6
IDENTIFIZIERUNG
VON
HS-PXF
ALS
SINGLE-COPY
GEN
BEI
HOEHEREN
EUKARYONTEN
.
59
6.1
SOUTHERN
BLOT
ANALYSEN
INDIVIDUELLER
HUMANER
DNA-PROBEN
.
59
6.2
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
VON
NEUN
EUKARYONTISCHEN
SPEZIES
.
59
II
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SUBZELLULAEREN
LOKALISATION
UND
POSTTRANSLATIONALEN
MODIFIKATION
DES
PROTEINS
HS-PXF.
_
.
_
.61
1
PROKARYONTISCHE
EXPRESSION
VON
GST/HS-PXF
FUSIONSPROTEINEN
UND
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
.
61
3
NACHWEIS
DER
CARBOXYTERMINALEN
FAMESYLIERUNG
.
64
HI
SEQUENZVERGLEICHE
VERWANDTER
AMINOSAEURESEQUENZEN
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINER
KONSERVIERTEN
REGION
.
66
1
SEQUENZAEHNLICHKEIT
ORTHOLOGER
PXF
PROTEINE
VON
VIER
SAEUGERSPEZIES
.
66
2
SEQUENZAEHNLICHKEIT
VON
PXF
ZU
ZWEI
PROTEINEN
WENIGER
NAH
VERWANDTER
EUKARYONTEN
.
68
2.1
STARKE
AEHNLICHKEIT
DER
PROFILE
HYDROPHILER
UND
HYDROPHOBER
REGIONEN
.
69
2.2
MULTIPLES
ALIGNMENT,
ANALYSE
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINES
KONSERVIERTEN
MOTIVS
.
70
TV
D
DISKUSSION.72
1
DIE
VOLLE-LAENGE
CDNA
VON
HS-PXF'.
MULTIPLE
TRANSKRIPTE
DURCH
ALTERNATIVE
POLYADENYLIERUNG
UND
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
.
72
2
GENOMISCHE
STRUKTUR
UND
5
'
REGULATORISCHE
REGION
DER
PXF
GENE
VON
MENSCH
UND
MAUS
.
76
3
DAS
HS-PXF
PROTEIN:
FAMESYLIERUNG
UND
ASSOZIATION
MIT
PEROXISOMEN
.
81
4
KONSERVIERUNG
VON
PXF
BEI
HOEHEREN
EUKAIYONTEN
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINER
KONSERVIERTEN
REGION
.
84
5
PXF
ALS
KANDIDAT
FUER
EIN
PEROXISOMALES
ASSEMBLIERUNGSPROTEIN
.
86
E
ZUSAMMENFASSUNG
.91
F
LITERATURVERZEICHNIS.93
ANHANG
.
105
DANKSAGUNG
.
117
LEBENSLAUF.
.
119
PUBLIKATIONSLISTE
.
120 |
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